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应用RT—nested PCR检测猪流行性腹泻病毒的研究 总被引：5，自引：0，他引：5
将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ02，经过胰酶处理后，在Vero细胞上增殖。利用Gen-Bank中的基因序列设计合成了2对M基因引物。应用RT-PCR和RT-nested PCR检测分别扩增出HLJ02的854bp的M全基因片段和412bp的M基因部分片段，而在猪传染性胃肠炎病毒中和Vero培养液中未扩增出上述产物。结果表明，RT-nested PCR检测可用于检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）。 相似文献
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作者从广东地区表现有流行性腹泻症状的病猪采集的病料通过在细胞维持液中加入每 ml 含60μg 胰酶量的细胞培养方法,可使 Vero 传代细胞在培养24小时,60%细胞出现细胞融合,形成合胞体等特征的细胞病变,并且,经过动物回归试验、电子显微镜观察、血清学、病毒核酸型鉴定和理化特性等试验结果表明,分离获得的病毒分离物为猪流行性腹泻病毒(PEDV)分离获得的 PEDV,在含有胰酶的细胞维持液条件下,用 Vero 传代细胞培养传代12代,转入不加胰酶条件下,再用 Vero 传代细胞传19代,PEDV 可适应于 Vero 传代细胞生长,并出现有特征的细胞病变,继后,转用 PK15传代细胞再传22代,PEDV 已能适应于 PK15传代细胞生长,其细胞病变程度较 Vero 传代细胞更明显易看,PEDV 在 Vero、PK15传代细胞培养物中连续传53代.转用 ST 传代细胞培养,再传4代,可见 ST 传代细胞出现明显的细胞病变.本试验证明、将分离的 PEDV 先后适应于 Voro、PK15和ST 传代细胞的方法是成功的,并已使之成为适应传代细胞的 PEDV 细胞毒株,命名为 PEDV-G1株,其毒价为10~(-5·37-6·1)TCID_(50)/0.05ml。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2016,(4)
为确定2014年河北某猪场哺乳仔猪群腹泻的病原,本研究从该发病猪场采集了22份临床样品,采用PCR方法进行腹泻病原的检测。结果显示其中17份样品为猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性,而猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)均为阴性。选取其中5份PEDV阳性样品在Vero细胞中进行病毒的分离,结果显示,仅一份样品在接种细胞24 h后即可观察到细胞病变。对病变细胞进行RT-PCR及间接免疫荧光鉴定均为PEDV阳性。将分离的病毒株命名为He B10/2014。将其在Vero细胞中传至F5代次后病毒增殖明显增快,病毒滴度于感染细胞24 h达到峰值。对分离株的S基因进行克隆和测序分析,结果显示该病毒分离株符合国内近年来流行病毒株S蛋白的变异特征,即在S蛋白中存在4个连续氨基酸的插入(~(59)QGVN~(62))和3个氨基酸的缺失(~(14)0N和~(163)NI~(164))。本研究结果表明分离获得的HeB10/2014株为国内近年来新的PEDV流行株。 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(7)
应用Vero细胞对江苏省某猪场腹泻病料进行病毒分离,通过细胞病变观察、RT-PCR扩增、动物回归试验对病毒进行鉴定,通过半数致死量测定病毒的致病性。结果显示,成功分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),命名为PEDV JS14株。该毒株在Vero细胞上盲传至4代出现细胞病变,主要表现为细胞面粗糙、颗粒增多,细胞多核呈空斑样,细胞脱落等病变特征;分离株口服感染5头7日龄仔猪全部出现典型的临床症状,其中4头死亡。F6代培养物以不同滴度口服接种15头7日龄的仔猪,其半数致死量为10~(5.0)TCID_(50)/mL。结果表明,本次分离的PEDV为强毒株,为进一步的生物学特性研究奠定了基础。 相似文献
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为了对疑似猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染病例进行确诊,并掌握致病原与其他流行毒株的基因差异性,试验采用病毒分离与细胞病变观察、PCR检测、中和试验、间接免疫荧光试验、S1基因序列分析等方法对该病例进行了研究。结果表明:临床病料接种Vero细胞盲传至18代后可产生典型的细胞病变,临床病料样品及各代次分离株病毒的PCR检测均为阳性,该毒株的TCID_(50)为1×10~(-6.61)/mL,该病毒可被PEDV阳性血清特异性中和,间接免疫荧光试验中可见明显的特异性绿色荧光,该病毒的S1基因核苷酸序列与GenBank中PEDV S1基因序列同源性在65.2%~100%之间,遗传进化关系中该病毒与近几年新分离株属于同一个大分支,与CV777等经典毒株亲缘关系较远。说明分离株病毒为国内近几年流行的新型PEDV。 相似文献
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《动物医学进展》2021,42(2)
旨在对疑似猪流行性腹泻(PED)患猪的病料进行病毒分离,并制备灭活疫苗。从因腹泻病死的7日龄内仔猪的小肠组织及内容物中,分离出1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),命名为PEDV-GS。用Vero细胞对病毒进行扩增,病毒液中加入终浓度为0.7 mg/mL甲醛,28℃灭活48 h,加入ISA 61 VG佐剂进行乳化,经稳定性、安全性和效力试验,初步研制出猪流行性腹泻的流行毒株灭活疫苗。疫苗免疫妊娠母猪后对仔猪进行母源中和抗体检测、安全性和有效性试验。结果表明,制备的猪流行性腹泻灭活疫苗稳定性和黏度检测都合格,且对仔猪安全有效,对妊娠母猪产仔数量及质量无影响,其被动免疫抗体至少持续到仔猪产后28 d。试验成功制备了具有安全性和高保护率的猪流行性腹泻灭活疫苗。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒SD201604株的分离鉴定及致病性研究 总被引：2，自引：2，他引：0
本研究旨在获得猪流行性腹泻病毒（PEDV）分离株,并对其致病性进行研究。应用Vero细胞从山东某猪场腹泻病料中进行病毒分离,通过细胞病变、免疫荧光试验、电镜观察和RT-RCR进行鉴定,并对分离株的S基因序列进行分析;应用103.5 TCID50/mL分离株口服接种3日龄仔猪并观察临床症状和病理变化;用不同滴度的分离株分别口服接种3日龄仔猪（3 mL/只）,统计各组仔猪的死亡率,确定最小致死量。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为PEDV SD201604株。该分离毒株能在Vero细胞上增殖,产生细胞病变,传代至F6代时病毒滴度可达103.5 TCID50/mL,免疫荧光试验和RT-RCR检测均为PEDV阳性。电镜观察可见直径大小约为100 nm的病毒粒子,有明显的囊膜和纤突,具有PEDV病毒粒子典型的形态特征,确定分离株为PEDV。S基因序列分析显示,分离株为国内流行的PEDV变异株。动物回归试验结果显示,口服感染该分离株的5头3日龄仔猪全部出现典型的PED临床症状和病理变化,其中3头死亡。最小致死量试验结果表明,口服感染3 mL病毒含量为104.5 TCID50/mL的分离株可使仔猪全部死亡。本试验结果可为PEDV的分离鉴定及生物学研究提供参考与借鉴。 相似文献
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2010年中国新出现了以新生仔猪高发病率、高死亡率为主要特征的变异株。为了明确山东地区猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）变异株特征，本试验利用Vero细胞对莒县某猪场的腹泻病料进行了病毒分离和体外传代培养。通过光学显微镜和细胞超薄切片观察、RT-PCR检测、间接免疫荧光试验、S基因序列进化分析、滴度测定和致病力试验进行病毒序列及特征分析，并探究接毒后细胞脱落时间的变化。光学显微镜观察发现，该病毒感染Vero细胞后能引起典型的合胞体病变；细胞超薄切片观察发现，病毒粒子多呈致密核芯，能引起宿主细胞线粒体肿胀，溶解；RT-PCR检测和间接免疫荧光试验结果证实其为PEDV，最终通过测序证实该毒株为变异毒株。体外传代培养至100代过程中，随着病毒代次升高，其对细胞适应性不断增强。接毒后细胞脱落时间由48 h逐渐缩短至17 h，病毒滴度由6代时的105.3TCID50/mL逐渐升高至100代的107.5TCID50/mL。致病力试验结果显示，病毒毒力随代次升高逐渐下降，40代时对仔猪已无致病力。本试验结果为PEDV突变株致病基因的确定及疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
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用ＰＥＤＶＣＶ７７７株强毒适应Ｖｅｒｏ细胞系并传至１４７代。以ＰＥＤＶ沪株做效检用强毒。传代毒８３代之后适应了仔猪肾原代细胞。自９０代起进行了５次克隆纯化,克隆是在２次群斑（由５～７个单斑组成）的基础上,再进行３次单斑挑选（均是１ｍｍ以内小空斑）。以８３７斑５株继续传代并做系列试验。传代毒的毒价为１０７．０～１０７．５ＴＣＩＤ５０／０３ｍｌ。免疫接种途径为后海穴位。克隆后５代（总代次１０４代）～２５代的５批次主动免疫试验的总保护率为９５９２％（４７／４９）,对照组８８８％（１６／１８）发病。克隆后１７代～４０代的８批次被动免疫试验的总保护率为９６２％（７６／７９）,对照组１００％（１０／１０）发病。以克隆后２５代（总代次１２５代）进行稳定性试验,经６代次返祖传代毒力未返强,仍是稳定的,已符合弱毒株的标准。在与ＴＧＥ弱毒株组合制备的二联弱毒苗的初步田间试验中取得良好效果。 相似文献
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本研究旨在分离猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）变异株,通过悬浮培养工艺制备成高效价的PEDV灭活疫苗。2017年从中国多个规模化猪场采集腹泻病死仔猪的小肠及其内容物200份,通过RT-PCR方法进行PEDV检测并测序,筛选一株PEDV变异株,将其在2 L反应器里悬浮培养的Vero细胞上进行病毒分离与传代培养,收获的病毒液鉴定后测定TCID50,经甲醛灭活后加入氢氧化铝胶佐剂配制成PEDV灭活疫苗,对其物理性状、稳定性、黏度、无菌等进行检验,检验合格后免疫妊娠母猪及所产仔猪,对其安全性和免疫效力进行研究。结果显示,200份病料中有86份为PEDV阳性,将筛选的PEDV变异株病料在Vero细胞上传至第5代时出现细胞病变,传至第10代收获病毒液,经鉴定后确定为PEDV变异毒株,并命名为PEDV-GF10株。收获的病毒液浓缩后测得病毒滴度可达1×108.0 TCID50/mL。疫苗检验合格后在母猪产前40和25 d时试验组后海穴肌内注射4 mL疫苗,空白组不免疫,结果显示试验组与空白组母猪的生产情况无明显差异,所产3日龄仔猪分别免疫不同剂量后体温无显著差异,表明该疫苗对母猪和仔猪均安全性良好。随机挑选试验组与空白组母猪所产3日龄仔猪各20头,分别口服4 mL PEDV-F10病毒培养物,空白组母猪所产仔猪在攻毒24 h后PEDV发病率为100%,抗体均为阴性;试验组母猪所产仔猪只有10%出现了轻微的腹泻症状,仔猪获得了高达90%保护率,且仔猪被动免疫后抗体能持续至35 d以上。以上结果表明,PEDV-GF10变异株通过悬浮细胞培养后病毒滴度显著提高,研制的PEDV-GF10株灭活疫苗安全有效,能够对中国的PEDV变异株达到有效防控,为国内PED防控提供了理论依据。 相似文献
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This study was aimed to isolate a mutant strain of porcine epidemic diarrhea virus and prepare a PEDV inactivated vaccine with high valence by suspension culture process for immunizing against PEDV effectively in China.200 small intestines and theirs contents of diarrhea piglets died of diarrhea,collected from many large-scale pig farms in China,were detected by RT-PCR and sequenced,a mutant strain of porcine epidemic diarrhea virus was selected and put on the suspension-cultured Vero cells in a 2 L reactor for virus isolation and continuous cell culture,the harvested virus suspension,which was identified and determined TCID50,was inactivated by formaldehyde and mixed with aluminum hydroxide gel adjuvant to prepare PEDV inactivated vaccine.After its physical behavior,stability viscosity,sterility test were checked out,the safety and immune efficacy were studied by immunizing the pregnant pigs and theirs piglets.The results were as follows:86 samples were detected positive in 200 samples,cytopathy occurred after the mutant strain samples screened were passaged to 5th generation,the virus suspension was harvested in 10th generation and identified as a mutant strain of PEDV,named PEDV-GF10 strain.The virus titer of harvested virus suspension was measured up to 1×108.0 TCID50/mL after concentrated.After the vaccine was checked out,the sows,40 and 25 days before delivery in experimental groups,were injected into Xuehai acupoint with 4 mL vaccine and the pigs in blank group were free of immunifications.The results showed that there were no obvious differences in the production status of the sows in experimental groups and blank group and the temperature of theirs 3-day-old healthy piglets injected different doses of vaccine,and the vaccine was safe to the sows and piglets.Forty 3-day-old piglets producted by pregnant sows in experimental groups and blank group were randomly selected and taken 4 mL 1×108.0TCID50/mL F10 virus culture.The PEDV morbidity of piglets in blank group was 100% after injection and the antibodies were negative;10% piglets in blank group had mild diarrhea symptoms,the protection rate was up to 90%,antibody of passive immunity in piglets lasted for more than 35 days.Virus titer of mutant strain of PEDV-GF10 improved a lot by suspension cell culture,the PEDV-GF10 inactivated vaccine was safe,and could effectively prevent and control the variation strain of PEDV in China. 相似文献
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猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其灭活疫苗免疫保护效果研究 总被引：5，自引：0，他引：5
为筛选能用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗研发的流行毒株,收集PEDV阳性病料,以Vero细胞进行病毒分离试验,并对分离毒株进行外源病毒检测、病毒培养特性研究、仔猪毒力试验及免疫效力试验等。9份PEDV阳性病料共分离到3株病毒,分别命名为PEDV-SC12、PEDV-JS12、PEDV-JX12。其中PEDV-SC12株存在支原体污染;PEDV-JS12株与PEDV-JX12株均能被PEDV特异性阳性血清中和;PEDV-JS12株能在Vero细胞上增殖并产生细胞病变,但适应细胞45代以后病毒培养效价仍然偏低;PEDV-JX12滴度能维持在106.0 TCID50/mL以上。PEDV-JX12株毒力试验显示,该分离株能够通过人工感染复制出腹泻病例,并能从发病动物体内检测到感染的病毒。免疫攻毒保护试验显示,以PEDV-JX12株制备的灭活疫苗免疫母猪,对所产仔猪攻毒后免疫组6.25%(1/16)发病,对照组100%(8/8)发病。说明PEDV-JX12株能够适应细胞培养,免疫接种母猪能给仔猪提供有效保护,可以用于PEDV流行毒株的疫苗研发。 相似文献
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MAO Li-hong ZHANG Shuang-xiang ZHOU Bi-jun WANG Wei HU Xing-yi CHENG Zheng-tao WEN Ming WANG Kai-gong 《中国畜牧兽医》2017,44(6):1621-1629
In order to understand the characteristics of S gene of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) in Guizhou province, and grasp the genetic variation of PEDV, according to 3 pairs of specific primers designed in the test, S gene of 6 strains of PEDV from Guizhou were amplified by RT-PCR, cloned and sequenced. Nucleotide sequence and phylogenetic tree of 6 strains of PEDV from Guizhou and reference strains were analyzed by biological information software. The result showed that the length of S gene genome of 6 strains of PEDV from Guizhou was 4 161 bp, encoding 1 387 amino acids, and the nucleotide homologies of domestic and foreign PEDV reference were from 93.3% to 98.8%, the amino acid identity were from 91.6% to 98.9%. Phylogenetic tree analysis results showed that the 6 strains were close to the American strain, Vietnam strain and the Shandong strain.They were far from the CV777, LZC, Brl and 83P-5.The experiment showed that the S gene of PEDV in Guizhou had a certain degree of amino acid change in recent year with a trend of variation. The study provided a theoretical basis for the prevention and control of PEDV in Guizhou province. 相似文献
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为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）S基因的特点,掌握其遗传变异情况,本试验设计3对特异性引物对6株PEDV贵州株S基因进行全基因RT-PCR扩增、克隆及序列测定;应用生物信息学软件将6株PEDV贵州流行株与参考毒株进行同源性与系统进化分析。结果显示,6株PEDV贵州流行株S基因的全基因长为4 161 bp,编码1 387个氨基酸,与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性在93.3%~98.8%之间,氨基酸同源性在91.6%~98.9%之间;进化树分析结果显示,6株流行毒株与美国毒株、越南毒株和山东毒株亲缘关系较近;与CV777株、LZC、Brl、83P-5亲缘关系较远。结果表明,PEDV贵州地方流行毒株S基因编码的氨基酸存在一定程度变化,近年来呈现变异趋势。本研究可为贵州省PEDV的防控提供一定的理论依据。 相似文献
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To evaluate the specific immune responses induced by recombinant Lactococcus lactis(L.lactis) which expresses porcine epidemic diarrhea virus(PEDV) S1 protein through oral administration,the spike gene fragment of PEDV was amplified from PEDV SDLY strain to construct p MG36 e-S1 recombinant plasmid.The recombinant plasmid was then electro-transferred into competent cells of L.lactis MG1363,to prepare the recombinant L.lactis expressing S1 protein of PEDV.The expression of target protein was identified by SDS-PAGE and Western-blot.New Zealand white rabbits were orally administered with the recombinant strain;the antibody titer in intestinal mucosa and serum was detected by neutralizing test;and the specific Ig G in serum was evaluated by indirect ELISA.The results showed that the recombinant L.lactis could effectively induce high level of Ig G in serum and high level of mucosal immune antibody.The recombinant L.lactis is qualified to be a potential oral vaccine because it could successfully stimulate both humoral and mucosal immune responses against PEDV. 相似文献