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1.
根据水貂阿留申病毒（Aleutian mink disease virus,AMDV）基因序列（GenBank登录号：NC_001662.1）设计1对特异性引物,通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了检测AMDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,该方法的灵敏度达10拷贝/μL,≥102拷贝/μL具有良好的特异性和重复性。同时利用该方法对8份疑似AMDV血清进行检测,结果6份阳性,阳性率为75%。本研究为水貂阿留申病的鉴别诊断及净群根除奠定了技术基础。 相似文献
2.
为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至p MD19-T载体,构建重组质粒p MD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法。分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×107拷贝/μL～1.43×100拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR (qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性。优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L (1.2μL)、探针终浓度为200 nmol/L (0.6μL)、退火温度为60℃。特异性试验结果显示,该方法仅可检... 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2015,(4)
为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据IBRVgB基因保守区域设计特异性引物和MGB探针,并采用矩阵法优化了PCR反应条件。结果显示,标准曲线相关系数(R2)为0.998,103拷贝/μL~108拷贝/μL内具有较好的线性关系。对牛呼吸道合胞体、牛病毒性腹泻粘膜病1型、牛副流感病毒3型的cDNA进行检测,结果均为阴性,特异性良好。该方法对IBRV检测的灵敏度可达到1.49×101拷贝/μL,是常规PCR灵敏度的100倍,重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于1.5%。应用建立的方法与普通PCR方法分别对17份疑似临床呼吸道症状牛鼻黏液拭子样品进行检测,该方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了约12%。研究表明建立的IBRV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于临床疑似样品的快速定量检测。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2016,(3):407-411
为建立犬瘟热病毒(CDV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成2对通用引物和1条通用探针,通过体外转录构建绝对定量标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立CDV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达4.02拷贝/μL,比普通RT-PCR方法的灵敏度高出100倍,具有良好的重复性。对犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)核酸检测为阴性,具有很好的特异性。研究结果表明,建立的CDV荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为犬瘟热的早期诊断提供了重要的技术支撑。 相似文献
5.
为了建立快速检测水貂犬瘟热病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,试验根据犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因的保守区域设计一对特异引物和探针,优化体系反应条件,并进行敏感性试验、特异性试验、重复性试验和水貂外周血淋巴细胞感染犬瘟热病毒后的检测。结果表明:建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法最低检出量为3.96个拷贝;与水貂细小病毒、水貂阿留申病毒均无交叉反应;批内重复和批间重复循环阈值(Ct)变异系数均小于1%;应用该方法可成功检出水貂外周血淋巴细胞中的犬瘟热病毒。说明建立的检测方法敏感性、特异性、重复性好,可以用于水貂犬瘟热病毒的临床检测。 相似文献
6.
鹅细小病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及临床应用 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立一种能定量检测鹅细小病毒(GPV)的荧光定量PCR方法,根据GenBank已收录GPV-VP3基因保守区设计1对特异引物和TaqMan探针,经反应条件优化、标准曲线建立,以及敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,该方法在10~7~10~2拷贝/μL具有良好的线性关系(R2=0.999);灵敏度是普通PCR方法的100倍;对其他3种常见禽病毒无特异性扩增,具有较好的特异性;组内与组间的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对临床20份疑似GPV感染鹅病料进行检测,检出率比普通PCR高10%。表明本试验建立的TaqMan荧光定量PCR方法准确、稳定、灵敏和特异,可以用于GPV临床定性与定量检测。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2017,(8)
为建立猪细小病毒7型(PPV7)的快速定量检测方法,本研究根据PPV7(KU563733.1)基因序列设计一对特异性引物,扩增155 bp的PPV7衣壳蛋白基因,构建重组质粒pClon007-PPV7,以其作为标准品建立了PPV7的SYBR GteenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在5.00×10~9拷贝/μL~5.00×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该方法对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒常见病原的检测均无特异性扩增,仅PPV7出现特异性扩增;该方法检测灵敏度可达5.00×10~1拷贝/μL;批内和批间变异系数均低于1%,具有较高的重复性和稳定性。对临床样品的检测结果显示,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为71.88%,比普通PCR法检测的阳性率提高了约4.55%。该研究方法的建立为PPV7提供了一种新的快速定量检测技术。 相似文献
8.
为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×106 ～1.0×101 copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×101 copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10-2 pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。 相似文献
9.
《畜牧兽医学报》2016,(11)
为建立便捷、灵敏的水貂阿留申病病毒(AMDV)纳米PCR检测方法,根据AMDV NS1基因的保守序列设计一对特异性引物,对纳米PCR反应的退火温度、胶体金浓度进行了优化;测序检测扩增基因是否发生变异;对特异性和灵敏度进行了评估。结果表明,此纳米PCR的最佳退火温度为51℃,普通PCR为55℃;加入胶体金最佳浓度在0.2~0.8nmol·L-1,纳米PCR与普通PCR产物测序相似性大于99%。特异性检测表明该纳米PCR方法只扩增AMDV而不能扩增犬瘟热病毒和水貂肠炎细小病毒。在粪尿样品检测中该纳米PCR敏感性比普通PCR高10倍。检测40份临床样品,结果表明该方法比对流免疫电泳检测敏感性提高,从而为用粪、尿等低病毒样品检测水貂阿留申病提供了一种新的有效方法。 相似文献
10.
《中国动物传染病学报》2019,(1)
本研究针对火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of turkey,HVT)FC-126毒株sorf1基因序列,设计特异性的扩增引物和探针,建立了检测HVT的TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的荧光定量PCR方法灵敏度高,最低可检测到1×10~2 copies/μL,比普通PCR灵敏10倍;对鸭瘟病毒、传染性喉气管炎病毒、鹅细小病毒、4型禽腺病毒和8型禽腺病毒均无特异性扩增,具有较好的特异性;组间和组内变异系数均小于1%,表明该方法重复性好。用建立的荧光定量PCR方法对82份HVT样品进行检测,结果43份为阳性,普通PCR只检测出30份阳性样品。结果表明本研究建立的HVT TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重要性好,为监测HVT的病毒含量提供了一种有效的手段。 相似文献
11.
《中国兽医学报》2020,(5)
建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。 相似文献
12.
《猪业科学》2015,(4)
为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×10~1拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献
13.
《中国预防兽医学报》2017,(6)
为建立犬细环病毒(TTCV)的快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的TTCV ORF7基因设计合成一对特异性引物,并对反应条件和反应体系进行优化,建立了检测TTCV的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示:建立的荧光定量PCR方法 Ct值与标准品模板在5.82×10~9拷贝/μL~5.82×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该检测方法仅对TTCV检测为阳性,而对狂犬病病毒、犬冠状病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒和犬副流感病毒均无特异扩增;该检测方法灵敏度可达5.82×103拷贝/μL。对27份犬血清样品检测结果显示,建立的荧光定量PCR阳性检测率为11.11%,而普通PCR方法检测阳性率为3.7%。本实验建立了TTCV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,对TTCV诊断及致病机制的研究提供了高通量的定量检测方法。 相似文献
14.
本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。 相似文献
15.
为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。 相似文献
16.
《中国预防兽医学报》2018,(11)
为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2018,(10)
为建立支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,本研究根据波氏菌属毒力基因DNT设计一对特异性引物,通过优化,确定最佳反应条件,建立了支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法。并对其进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测。以支气管败血波氏杆菌标准质粒为模板,建立标准曲线结果显示:标准品浓度在1.13×10~8拷贝/μL～1.13×10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关数R~2=0.997;该方法的灵敏度可达1.13×10~1拷贝/μL。建立的荧光定量PCR方法与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌等12种细菌和伪狂犬病毒、猪瘟病毒等4种病毒无交叉反应,具有良好的特异性;批内变异系数(CV)均小于2%,批间变异系数均小于4%,具有良好的稳定性。对临床样品的检测结果显示该方法检测的阳性率为57.7%,与普通PCR的符合率为93.24%。本研究建立的方法可以用作支气管败血波氏杆菌感染的早期诊断、快速检测与定量分析。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2015,(9)
为建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的SVCV N蛋白基因的保守性序列设计并合成特异性引物,建立了该病毒的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.99,在102拷贝/μL~109拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法对传染性脾肾坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、传染性皮下及组织坏死病毒和白斑综合征病毒其他水生动物病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对SVCV检测下限为100.76 TCID50/m L,比常规PCR灵敏100倍;批内和批间的变异系数均小于7.6%,重复性好。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,对SVCV的快速检测及定量检测具有重要意义。 相似文献
19.
20.
为建立犬瘟热病毒(CDV)SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,采用RTPCR扩增CDV F基因269bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了CDV荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.6×101拷贝/μL,与犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)均不发生交叉反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的CDV实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床犬瘟热(CD)的检测。 相似文献