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1.
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染性分子克隆的建立及拯救病毒的鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆,本实验根据PRRSV HuN4株基因组序列设计并合成PRRSV特异性引物,应用RT-PCR技术分6段扩增了PRRSV HuN4株全基因组cDNA.将扩增的各个cDNA部分重叠片段分别克隆于pBlueScript Ⅱ SK(+)载体中构建了感染性重组质粒pHuN4.并在病毒cDNA 5′末端引入sp6启动子序列便于后期的体外转录获得病毒的转录本,在3'末段Poly (A)尾引入Not Ⅰ酶切位点用于线性化pHuN4;此外,将HuN4基因组第14680位的A沉默突变为G产生一个Mlu Ⅰ酶切位点作为鉴定拯救病毒的分子标记.pHuN4通过酶切线性化后经体外转录及转染BHK细胞,并在Marc-145细胞中救获病毒.结果显示:救获的病毒能够在Marc145细胞引起明显的细胞病变;间接免疫荧光检测以及分子标记验证结果表明病毒拯救成功,而且拯救的病毒与亲本强毒生长曲线没有显著差异.利用拯救的第5代克隆病毒株对本动物进行致病性试验,结果显示实验猪在感染后第3d开始出现体温升高、厌食、消瘦等临床表现,发病率达100％,在感染后20 d内陆续死亡,表明拯救的病毒保持了与亲本病毒株相一致的致病特征,以上研究证实我们成功的构建并获得PRRSV强毒HuN4株感染性克隆,为从基因水平上研究PRRSV的致病机制提供了技术平台. 相似文献
2.
《中国预防兽医学报》2015,(4)
为鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的非必需基因区,本研究在高致病性PRRSV细胞致弱株感染性克隆Hu N4-F112的基础上,在其基因组ORF1b和ORF2a之间插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,并在外源基因3'端下游插入该病毒的转录调控序列6(TRS6),构建PRRSV-EGFP感染性克隆。将其体外转录制备的病毒全长RNA转染Marc-145细胞后,拯救获得了表达EGFP的重组病毒(r Hu N4-F112-EGFP)。将r Hu N4-F112-EGFP在Marc-145细胞中进行连续传代至20代,其外源gfp基因仍能够持续表达,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。与亲本病毒Hu N4-F112相比,重组病毒在病毒滴度、空斑形态等方面差异不显著;病毒生长曲线的结果显示,重组病毒具有良好的增殖能力。本研究结果表明,在PRRSV的ORF1b和ORF2a基因区中插入外源基因并未影响该病毒体外复制,该非必需基因区的鉴定为进一步研究以PRRSV疫苗为活病毒载体多价重组疫苗的研发奠定基础。 相似文献
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经典和高致病性PRRSV疫苗株嵌合病毒的构建及其免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
《中国预防兽医学报》2015,(4)
为研究经典和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)疫苗株间的生物学差异,本实验以经典PRRSV疫苗株CH-1R的全长感染性克隆p CH-1R为骨架,利用反向遗传操作技术分别将其ORF1a、ORF1b和ORF2-7替换为HP-PRRSV Hu N4-F112的相应片段,构建3个全长c DNA嵌合质粒。将构建的3个重组c DNA质粒经体外转录后转染BHK-21细胞,并于Marc-145细胞中传代,拯救出3种嵌合病毒,分别命名为r CH-1R-T1a、r CH-1R-T1b和r CH-1R-T27。病毒一步生长曲线结果表明,3种嵌合病毒在Marc-145细胞中的生长特性与亲本病毒CH-1R基本一致;动物实验结果显示,嵌合病毒实验组血清中PRRSV N蛋白抗体阳转率分别为3/3(r CH-1RT1a)、2/3(r CH-1R-T1b)和1/3(r CH-1R-T27),而CH-1R免疫组血清N蛋白抗体检测始终为阴性。以上结果表明,HP-PRRSV Hu N4-F112非结构蛋白在N蛋白抗体产生中起关键辅助或协同作用。 相似文献
4.
为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验分别以HP-PRRSV强毒HuN-F5株及其传代致弱的疫苗病毒株HuN4-F112为亲本病毒,利用反向遗传操作技术分别将ORF1a、ORF1b或ORF2-7编码序列在强弱毒之间互换。将6种含有不同嵌合基因的全长病毒基因组的重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞,然后在Marc-145细胞中传代,拯救的重组病毒经RT-PCR、测序和免疫荧光鉴定,并分别命名为rHuN4-F5-ORF1a、rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7(以强毒为骨架)和rHuN4-F112-ORF1a、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7(以弱毒为骨架)。进一步测定这些病毒在Marc-145上的生长曲线,结果显示:以强毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F5-ORF1a生长滴度显著高于亲本强毒rHuN4-F5,而以弱毒为骨架的嵌合病毒rHuN4-F112-ORF1a在细胞上的生长滴度低于其亲本弱毒rHuN4-F112,其他片段替换对病毒在细胞上的生长没有明显影响。本实验结果提示ORF1a对于PRRSV在体外细胞培养上的生长调节起重要作用。 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(7):1092-1097
构建了一种利用CMV启动子的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)反向遗传操作系统。在获得XX-2012株HP-PRRSV全长cDNA的基础上,将CMV真核启动子序列置于该病毒全长cDNA的5′端,获得含有CMV启动子和XX-2012株HP-PRRSV全长cDNA克隆的重组质粒,将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞拯救病毒。结果显示:转染细胞后获得了拯救病毒,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记(突变产生的MluⅠ酶切位点)。本试验建立了一种简单、操作方便、节约时间和成本的HP-PRRSV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展HP-PRRSV的相关研究奠定了基础。 相似文献
7.
为了追踪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syn-drome virus,HP-PRRSV）毒力逐渐减弱的分子轨迹,我们以HP-PRRSV亲本毒HuN4株及其系列传代致弱毒株为研究对象,对HuN4株及其不同代次毒株其全基因序列进行了序列比较分析。结果显示由高致病性的亲本毒HuN4株到无致病性的F112代的疫苗毒,共有65个核苷酸发生突变,其中导致41个氨基酸发生突变,这些突变的氨基酸分散性的存在于不同基因区域。与已经报道的高致病性JXA1株及其致弱毒株JXA80株相比较,可以看到两个强毒株毒力致弱的演变轨迹并不完全相同,二者之间不仅氨基酸突变数量不一致,而且突变氨基酸的位置也不完全相同,但其共同特点是由强毒株到弱毒株的变化过程中,突变率较高的结构蛋白相一致,突变率较高的非结构蛋白基本一致。分析结果提示我们决定高HP-PRRSV毒力强弱的因素可能不是由单个氨基酸的突变来决定的,推测是由一个基因或多个基因或多种因素共同造成的,同时也使我们认识到PRRSV的非结构蛋白区在病毒毒力变化中可能发挥重要作用。 相似文献
8.
为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒非结构蛋白对病毒毒力的影响,本研究通过反向遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,经间接免疫荧光鉴定拯救的重组病毒,分别命名为rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112-nsp10、rHuN4-F112-nsp11,测序证实HuN4强毒nsp9、nsp10、nsp11片段正确替换入HuN4-F112骨架。拯救病毒在Marc-145细胞上的生长曲线显示,rHuN4-F112-nsp9和rHuN4-F112-nsp10在前24 h的复制速度明显高于rHuN4-F112-nsp11和拯救的母源毒rHuN4-F112,36 h后无明显差别。将拯救病毒以105TCID50剂量接种仔猪,对体温、临床症状、病毒血症、组织器官病变情况进行观察和检测。结果显示,拯救病毒rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112 nsp10、rHuN4-F112 nsp11在致病性、发热以及病毒血症强度上与rHuN4-F112无显著差异,提示单独nsp9、nsp10、nsp11对病毒致病性以及病毒在体内的复制无影响。 相似文献
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致弱过程中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株部分生物学特性的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征(HP-PRRS)弱毒疫苗,将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株进行了致弱驯化,在Marc-145细胞上对其进行了3次蚀斑克隆和连续传代.该毒株的病变速度随着代次增高逐渐加快,传至80代以后其病毒滴度达到最高并保持稳定;电镜观察发现低代次病毒粒子形态以棒状为主,高代次病毒粒子形态以球形为主;蚀斑形态比较发现低代次病毒形成的蚀斑大小不一,而高代次病毒形成的蚀斑大小均一;序列分析和病毒抗原性分析表明HuN4株传代过程中GP5蛋白羧基端1个主要抗原表位(196QWGRL200)发生突变即196Q突变为196R,针对该表位的单克隆抗体只与HuN4株低代次病毒反应而不与高代次病毒反应.以上结果表明:在Marc-145细胞上经蚀斑克隆和连续传代致使HP-PRRSV HuN4株部分生物学特性发生改变,这些特性的改变在病毒弱化过程中的作用还有待进一步的研究. 相似文献
10.
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)5'端非病毒核苷酸对感染性克隆拯救的影响,优化PRRSV反向遗传操作平台,本试验构建了含有CMV启动子的PRRSVJXA1-R株全长克隆质粒,在CMV启动子的下游引入锤头核酶序列,并在PRRSV基因组的5'端上游和锤头核酶下游之间引入非病毒核苷酸,分别构建成5'端含有非病毒核苷酸GG和GCTAGC的PRRSV全长感染性cDNA克隆Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV。新构建的两株克隆质粒直接转染BHK-21细胞拯救,48h后用间接免疫荧光检测病毒M蛋白,结果表明两株克隆均可拯救成活,测定Pgg-PRRSV和PNhe-PRRSV转染上清的病毒毒价分别为3.0和1.25TCID50/mL,拯救病毒在Marc-145细胞上传3代后均稳定在6.5TCID50/mL,病毒滴度无明显差异。本研究成功构建了两株5'端上游含有非病毒核苷酸的PRRSV基因组全长感染性cDNA克隆,表明PRRSV的5'端上游含有两个非病毒核苷酸GG拯救效率较高,且5'端的病毒外源核苷酸对拯救的影响仅存在于拯救的最初阶段。 相似文献
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猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救 总被引：3，自引：0，他引：3
采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序.经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5'和3'末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7.利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞.通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子.猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具. 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响全球养猪业的一种重要病原。近年来,国内新出现的类NADC30毒株导致临床PRRS疫情再次出现。本研究旨在构建PRRSV类NADC30毒株CHsx1401的感染性克隆,以期为研究该类毒株遗传变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制奠定基础。将类NADC30毒株CHsx1401全长基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,分别将扩增片段克隆到pJET1.2载体构建中间质粒,将4个克隆依次连接并克隆到改造后的低拷贝质粒载体pWSK29中,构建全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,并在全长cDNA克隆的C与D片段之间通过同义突变(T11582G)引入AscⅠ酶切位点,作为遗传标记,用于区分拯救病毒与亲本病毒。采用脂质体LTX将全长cDNA克隆质粒转染至MARC-145细胞拯救病毒。结果表明,成功构建出全长cDNA克隆pWSK-CHsx1401,转染MARC-145细胞后传至第二代可观察到明显的细胞病变(CPE)。经间接免疫荧光、RT-PCR和序列测定鉴定结果表明,从全长cDNA克隆可拯救出病毒。拯救病毒(RvCHsx1401)在MARC-145细胞上可稳定传代,增殖动态与亲本病毒相似,在MARC-145细胞上各时相的病毒滴度略低于亲本病毒。本研究构建的类NADC30毒株CHsx1401的全长cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;拯救病毒与亲本病毒的体外增殖特性相似,为研究该毒株的变异与演化以及与其他毒株致病性差异的分子机制提供了技术平台。 相似文献
13.
利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础. 相似文献
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为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)与致弱PRRSV的重组病毒,本研究在PRRSV致弱株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS与HP-PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,利用SOE-PCR技术将强弱毒的nsp2区域进行互换,构建了nsp2基因替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆.将构建的嵌合克隆转染MA104细胞,4d后观察到典型的细胞病变.通过RT-PCR和间接免疫荧光证明获得了强弱病毒株之间nsp2基因互换的嵌合病毒.这些嵌合病毒的构建和相应反向遗传操作平台的建立,为进一步研究HP-PRRSV的致病机制及相关疫苗的研发奠定了基础. 相似文献
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猪脑心肌炎病毒分离株BJC3全长感染性克隆的构建与拯救病毒鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
本研究旨在建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的感染性克隆技术.利用RT-PCR分3段扩增出脑心肌炎病毒BJC3株的全基因组cDNA,依次克隆至低拷贝质粒pWSK29,构建出全长质粒pWSKBJC3/w,经体外转录和转染BHK-21细胞拯救病毒.结果表明,构建的全长cDNA克隆具有感染性,在BHK-21细胞上可拯救出病毒.拯救病毒(命名为rVBJC3W)在BHK-21细胞上的生长特性与其亲本病毒BJC3一致,并保持了对小鼠的致病性.本研究成功构建了中国第1株猪脑心肌炎病毒的感染性克隆,为深入研究其分子致病机制提供了必要的工具. 相似文献
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为研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)不同致弱代次病毒对断奶仔猪胸腺的损伤,本研究选用HP-PRRSV HuN4株在Marc-145细胞中传代致弱的F5、F15、F23、F30代及弱毒疫苗HuN4 F112代分别接种30日龄的PRRSV抗原及抗体阴性健康断奶仔猪。实验结果显示:HuN4 F30感染组胸腺的眼观病变、胸腺重量、病理组织学变化、病毒载量及胸腺细胞凋亡比例均与F23感染组有显著差别(p<0.05)。本实验结果表明,HuN4 F23代仍然能够引起仔猪胸腺萎缩并导致机体免疫抑制,而F30代已不能引起断奶仔猪胸腺萎缩现象。因此,HP-PRRSV HuN4 F23、F30代可以作为研究HP-PRRSV HuN4致胸腺萎缩的分子机制的关键代次。本研究为进一步研究HP-PRRSV感染诱导仔猪胸腺萎缩和胸腺细胞凋亡的分子机制奠定了基础。 相似文献
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为构建禽网状内皮组织增生症病毒(REV)MD-2株的感染性克隆,将MD-2株的前病毒基因组全长克隆至pMD18-T Simple载体中构建MD-2全长质粒,经转染CEF细胞后进行病毒拯救及鉴定,并对拯救病毒进行了生物学特性研究。结果表明,成功构建了MD-2全长质粒,拯救病毒感染CEF细胞后用间接免疫荧光试验检测到病毒抗原;拯救病毒的生长特性与亲本病毒相比无明显差异。随后对env基因进行了多个位点的定点突变,并拯救出相应的突变株,结果显示env基因第1433位碱基突变后不能拯救出病毒,推断1433位的突变为致死性突变。MD-2株感染性克隆的构建和病毒拯救的研究为继续研究REV基因和蛋白功能提供了技术支持。 相似文献
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《中国预防兽医学报》2015,(9)
为建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)HB10株cDNA感染性克隆,本研究利用反向遗传操作技术,采用RT-PCR一次性扩增EMCV-HB10株全长基因组(包括5'和3'UTR)序列,并直接克隆于低拷贝载体pOK12中,构建了EMCV感染性重组质粒pOK12-EMCV-HB10。将重组质粒体外转录后转染BHK-21细胞进行病毒拯救。结果显示,转染细胞36 h后,出现典型的细胞病变。拯救病毒rEMCV-HB10全基因组经测序鉴定显示,与亲本病毒开放阅读框比较,其仅在1D基因出现两个核苷酸突变:即A37G(R13K)和G187C(M63I),该突变可以作为区别亲本病毒的标志。间接免疫荧光和生长曲线试验结果显示,这两个突变并不影响VP1蛋白的表达及病毒拯救,并且拯救病毒与亲本病毒具有相似的生长特性。本研究构建了感染性EMCV-HB10 cDNA克隆,为深入研究EMCV的致病分子机理提供了有效的反向遗传操作平台。 相似文献
19.
《中国动物传染病学报》2015,(4)
本研究将坦布苏病毒MM1775株全基因组分3段克隆,获得3个重组质粒,利用融合PCR方法扩增得到5'端含有T 7启动子的病毒全长c DNA,经体外转录得到感染性的RNA,将RNA转染DF-1细胞,48 h后出现细胞病变。当细胞病变达到90%,将细胞上清接种DF-1细胞,72 h后进行间接免疫荧光(indirect immunofulorescence,IFA)和RT-PCR鉴定,结果表明拯救病毒成功。序列测定结果显示,拯救毒的全基因组序列与亲本毒完全一致,表明MM1775反向遗传操作系统构建成功,为进一步研究坦布苏病毒致病性等相关分子机制奠定了基础。 相似文献
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猪瘟病毒（CSFV）疫苗株Thiverval株与亲本病毒Alfort株相比,最明显的区别就是其3′-UTR含有一定长度的插入序列。本研究通过反向遗传学操作,构建了3′-UTR含有19nt、32nt以及插入片段完全缺失的CSFVThiverval株全长cDNA感染性克隆,将突变病毒基因组进行体外转录,利用BHK-21细胞转染、PK-15细胞传代增殖的方式成功的从3种重组突变感染性克隆中拯救出活病毒粒子,表明CSFV疫苗株3′-UTR插入片段并不影响病毒的拯救。通过3′-UTR二级结构模拟,发现疫苗株的插入片段导致3′-UTR空间构型发生改变、自由能升高、影响二级结构的稳定性,可能是导致疫苗株毒力减弱的原因之一。 相似文献