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1.
猪圆环病毒2型-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
根据GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到表达PCV2 ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215（C）。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪圆环病毒2型和伪狂犬病毒的候选疫苗毒株。 相似文献
2.
本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII.将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC.通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度.重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传.本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础. 相似文献
3.
《中国兽医学报》2020,(2)
根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。 相似文献
4.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。 相似文献
5.
以构建的TK、gI、gE、US9、部分gN基因缺失的绿色荧光标记猪伪狂犬病毒rPRV-BE为亲本株,通过同源重组构建了表达猪瘟病毒(CSFV C株)主要免疫原性基因E2的重组伪狂犬病毒rPRV-CSFV PE2SC。经PCR、间接免疫荧光试验(IFA)鉴定证实构建正确,并能成功表达E2蛋白。同时,对重组病毒在PK15细胞中的遗传稳定性、增殖特性等进行了研究,结果显示第5、10、15、20代重组病毒经PCR均能扩增出与原代重组病毒相同大小的约为3469 bp含猪瘟病毒E2基因的重组片段;第20代重组病毒感染细胞孔中出现明显的针对E2蛋白的荧光,表明重组病毒在体外连续传20代后仍能稳定遗传。一步生长曲线测定结果表明,与野毒PRV(SX株)、亲本毒rPRV-BE相比,重组病毒rPRV-CSFV PE2SC前期增殖速度较快,病毒滴度到达峰值的时间早,峰值病毒滴度低于野毒,与亲本毒相当,最高病毒滴度依次为10~(6.7)TCID_(50)/mL、10~(8.0)TCID_(50)/mL、10~(7.0)TCID_(50)/mL。结果显示构建的重组病毒具有良好的遗传稳定性及体外复制能力,为进一步对其免疫效果的评价以及PRV基因缺失重组疫苗的研制奠定基础。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2015,(9):1422-1428
为了获得表达猪细小病毒(PPV)VP2蛋白和细胞因子猪白细胞介素-18(IL-18)的重组猪伪狂犬病毒(PRV)。将PPV VP2基因和猪IL-18基因分别插入到PRV转移质粒PG中,得到重组质粒PG18-VP2。利用脂质体转染法将重组转移质粒PG18-VP2与猪PRV弱毒株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,以EGFP荧光标记,通过5轮蚀斑筛选纯化,成功获得表达PPV VP2蛋白和猪IL-18且带EGFP标记的重组伪狂犬病毒IL18-VP2-rPRV。用重组病毒感染ST细胞,12h后在荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光;通过RT-PCR证实感染细胞中含有PPV VP2和猪IL-18mRNA;Western-blot试验结果显示,重组病毒能表达具有生物活性的PPV VP2蛋白和猪IL-18。重组病毒经连续20次传代后感染细胞仍能发出绿色荧光,PCR检测表明VP2及IL-18基因在重组病毒中能稳定遗传。为进一步研究表达PPV VP2蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病毒的免疫效力奠定了基础。 相似文献
7.
为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株，本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物，BamHⅠ引入到引物的5′端，从HP-PRRSV毒株的RNA中，用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接，构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK-的ST细胞中，经病毒空斑纯化，获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞，经4轮病毒空斑纯化，最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序，证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基... 相似文献
8.
表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP.通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5.WA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达.该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
9.
为了获得口蹄疫病毒3AB基因重组伪狂犬病毒载体,试验以伪狂犬病毒TK/gⅠ缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,用限制性内切酶AscⅠ酶切基因组获得含完整PK基因的8.7 kb片段,将此片段克隆入pPolyⅡ载体的AscⅠ多克隆位点获得中间载体P8-AA;用限制性内切酶SacⅠ+NdeⅠ酶切质粒P8-AA,切去PK基因中的2 218 bp片段,在质粒P8-AA的PK基因缺失区插入已构建好的质粒pEGFP-3AB中含绿色荧光蛋白(EGFP)基因和3AB基因的完整表达盒,转染于猪肾细胞。结果表明:成功构建出可以用于同源重组的转移载体P8-EGFP-3AB,并且在猪肾细胞中成功表达了绿色荧光蛋白基因。 相似文献
10.
根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %. 相似文献
11.
猪伪狂犬病毒PCR检测方法的建立及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
根据猪伪狂犬病毒（PRV）gE基因序列保守区段,设计一对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬病毒野毒株与基因缺失疫苗株的PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果显示,该PCR方法可扩增出388 bp的目的片段;对模板的最低检测量为1.1 pg;与猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪支原体、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应,具有高特异性。采用建立的PCR方法对2014年以来全国不同地区81个猪场421份疑似病料进行检测,发现PRV猪场平均阳性率为35.80%,样品平均阳性率为 25.42%。该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于PRV的临床诊断和流行病学调查。 相似文献
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表达传染性喉气管炎病毒gB基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验 总被引：2，自引：0，他引：2
将200003批疫苗免疫4周龄SPF鸡,免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180和225 d分别采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清抗FPV抗体,结果表明重组疫苗免疫后14 d,免疫鸡血清抗体已经全部阳转,免疫后的21 d血清抗FPV的抗体出现峰值,此后便开始下降,到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平.用ILTV WG株和FPV 102株强毒进行的攻毒保护试验与血清检测的结果基本一致,在免疫后的5个月内可以使免疫鸡获得100%(10/10)保护,免疫后的6个月对ILT和FP的免疫保护分别为1/7和2/10,此时需要对鸡群实施二次免疫.其他5批疫苗(200001、200002、200101、200102和200103)免疫SPF鸡后5个月用ILTV WG株和FPV 102株攻击也获得了完全保护. 相似文献
13.
研究了由南京地区分离的鸭源流感病毒A/duck/Nanjing/21/95（H9N2？）感染商品来航鸡后，各组织脏器中病毒分离情况和病毒抗原分布。结果表明，禽流感病毒（AIV）可以从肾脏、肺脏、脾脏和心脏中分离出来，接种后3d(PI3），病毒在组织中的分离率最高，且又以肾脏的分离率最高。病毒抗原主要分布在肾小管上皮细胞、呼吸系统单核细胞和少量上皮细胞的胞核内，PI3时病毒抗原的检出率最高。这些结果表明，肾脏是该毒株复制的主要部位，肾脏的病变是病毒直接损伤的结果，而且该株AIV具备在呼吸系统内复制的潜力。 相似文献
14.
5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：0，他引：3
为建立同时检测流行性乙型脑炎病毒(JEV)、森林脑炎病毒(TBEV)、东方马脑炎病毒(EEEV)、西方马脑炎病毒(WEEV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)5种人兽共患脑炎病病毒的多重RT-PCR方法,本研究根据GenBank登录的相关病毒基因序列设计特异引物,通过优化引物组合及PCR反应条件,建立可同时检测5种病毒的方法,扩增片段长度分别为411 bp(JEV)、945 bp(TBEV)、193 bp(EEEV)、545 bp(WEEV)和769 bp(CHIKV);该方法具有良好的特异性,对病毒核酸最低检测拷贝数分别为7.1×103、3.6×103、2.2×103、5.6×103和5.1×103.该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,为以上5种人兽共患脑炎病病毒提供快速检测手段. 相似文献
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表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验 总被引：5，自引：0，他引：5
用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV～gB—F）制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180d分别采血，分离血清，检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14d，免疫鸡血清抗体已经全部阳转，免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值；此后便开始回落，到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性，之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组。分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8／10，第2个月对新城疫的保护为7／10，第3个月为2／10，因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8／10以上，免疫后的6个月对ILT为8／13．因此rF—PV-gB—F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。 相似文献
16.
鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响 总被引：2，自引：1，他引：1
为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。 相似文献
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将8日龄SPF鸡随机分组.分别接种rFPVHN、rFPVF、rFPVNHF重组禽痘病毒,接种量为每只鸡105PFU,另一组群用La Sota活苗经点眼、滴鼻接种10<'6>EID<,50>.于免疫后6d、12d和18d测定HI和微量中和抗体.结果发现,3种重组病毒均能刺激鸡群产生抗新城疫病毒特异抗体,但抗体产生时间比La Sota活苗缓慢,且抗体滴度亦低.然而共表达HN和F的rFPVNHF免疫鸡群的中和抗体水平明显比rFPVHN和rFPVF组群高.表明rFPVNHF的保护性免疫更优于HN或F单基因重组禽痘病毒. 相似文献
18.
环状病毒是牲畜常见的重要病原体,主要包括有蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒、马器质性脑病病毒和流行性出血热病毒等。这些病毒能够通过吸血性的库蠓传播。本文主要介绍了这几种病毒在世界各地的流行与传播情况。 相似文献
19.
2011年7月在甘肃省张掖地区发现发生花叶病的苜蓿田块,地块中病株呈现黄斑花叶、叶柄扭曲及整株矮化的症状。为明确其病原,采集病株后利用血清学和分子生物学方法对病样进行了检测。 DAS-ELISA、RT-PCR-RFLP及病毒CP基因序列测定分析结果表明,苜蓿病样受到番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)和苜蓿花叶病毒(Alfalfa mosaic virus,AMV)的复合侵染。这是国际上首次报道番茄花叶病毒对苜蓿的侵染,讨论了由这两种病毒引致病害的发生与防治。 相似文献