共查询到20条相似文献，搜索用时 171 毫秒
1.
【目的】构建原核表达载体p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18、大肠埃希菌Escherichia coli表达及产物纯化与活性检测,研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂,以对鸡的病毒性疾病进行防治.【方法】采用融合PCR(Fusion PCR)方法,利用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸将鸡α干扰素(Chicken interferon alpha,Ch IFN-α)与鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18,Ch IL-18)基因构建Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因并克隆入p ET-28a原核表达载体中进行原核表达.通过镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDSPAGE分析、Western-blot鉴定.采用细胞病变抑制法检测r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)及新城疫病毒(NDV)增殖活性.【结果和结论】成功构建并克隆了p ET28a-r Ch IFN-α-Ch IL-18融合基因.融合基因在大肠埃希菌中表达的r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白相对分子质量约为38 000,蛋白经纯化后纯度在90%以上.r Ch IFN-α-Ch IL-18蛋白在鸡胚成纤维(CEF)细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和NDV的活性明显高于单一r Ch IFN-α、r Ch IL-18蛋白的抗病毒活性. 相似文献
2.
用PCR技术从含鸡IL-18全长基因质粒扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白基因，亚克隆于pPROEX^TM HTa原核表达载体上，重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5a中，随机筛选到阳性重组质粒，经酶切和测序证实目的基因止确克隆于表达载体。IPTG诱导，重组蛋白以包涵体形式表达。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21．95％，用Ni-NTA树脂纯化重组蛋白，免疫SPF鸡制备抗血清。Western blot结果显示鸡抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异结合。ELISA可以检测到较高的多克隆抗体效价，表明此蛋白具有良好的抗原性。 相似文献
3.
鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备 总被引：1，自引：1，他引：0
应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。 相似文献
4.
鸡白细胞介素2(IL-2)是一种在机体免疫调节中具有多种功能的细胞因子.本研究将萧山鸡白细胞介素2基因克隆入原核表达载体pET-28b,获得了重组表达载体pET-28b-IL-2,将此重组表达载体转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达萧山鸡IL-2.SDS-PAGE结果表明,萧山鸡IL-2在大肠杆菌中得到了表达,以此表达产物制成油乳剂苗免疫家兔,用ELISA和Western blotting检测兔血中的多克隆抗体,结果均为阳性.因而为进一步开展鸡IL-2的结构和功能研究奠定了基础. 相似文献
5.
【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。 相似文献
6.
将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。 相似文献
7.
为了研究新型细胞因子制剂,构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA,以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出Ch IL-18和Ch IFN-γ基因片段,并连接到p MDTM18-T克隆载体上,构建重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ。以重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ为模板,利用多肽氨基酸接头和overlap技术,获得Ch IL-18-Ch IFN-γ融合基因并连接到克隆载体p MDTM18-T上,经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到p ET32a原核表达载体中。构建Ch IL-18-Ch IFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。 相似文献
8.
扩增萧山鸡白细胞介素2(IL-2)基因，将其插入真核表达载体pCI构建重组质粒pCI-IL-2，高压电击法将重组质粒转化入减毒沙门氏菌，并直接转染Vero细胞，提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号．用FITC标记的羊抗兔IgG进行间接免疫荧光试验，可检测到特异性黄绿色荧光．SDS-PAGE和Western blotting可检测到18．5kD和14．5kD的蛋白条带．表明减毒沙门氏菌能将重组质粒pCI-IL-2携带进入Vero细胞内表达IL-2，且表达产物具有免疫反应性，为今后研制鸡IL-2基因作为口服免疫增强剂提供了依据． 相似文献
9.
10.
中国荷斯坦奶牛IL-18基因的克隆与真核表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了克隆并表达中国荷斯坦奶牛白介素18(interleukin,IL-18)基因,用牛白介素18基因特异性引物对刀豆蛋白(ConA)刺激后荷斯坦奶牛外周血单核细胞(PBMCb)总RNA进行RT-PCR扩增,并将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定,将目的基因亚克隆到真核表达载体pGFP-C1中,构建了重组质粒pGFP-IL-18,转染BHK-21细胞,检测目的基因是否表达.结果:该基因全长582 bp,编码193个氨基酸,与羊、犬和猪IL-18基因相比,核苷酸序列有较高的同源性,但与小鼠和鸡IL-18基因相比有明显的种属差异,转染48 h后,可在转染细胞胞浆中检测到黄绿色的荧光,表明已成功克隆了中国荷斯坦奶牛IL-18基因,并实现了该基因在真核细胞中的表达. 相似文献
11.
应用RT-PCR技术从罗曼鸡脾淋巴细胞RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序。结果表明,获得了ChIL-18全序列,其大小为597 bp。将其成熟蛋白基因(510 bp)亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量为约46 kDa的融合蛋白,Western blot证实该融合蛋白可与鼠抗鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。用MTT法测定表明,重组蛋白能明显促进鸡T细胞转化的活性。 相似文献
12.
重组鸡白细胞介素2的诱导表达与生物学活性测定 总被引：6，自引：1，他引：6
将去除信号肽的鸡IL-2基因编码框克隆到原核表达载体pBAD/His B，实现了重组鸡IL-2(rchIL-2)蛋白在大肠杆菌中的高效表达。SDS-PAGE分析显示，表达蛋白的分子量约为18 kD。用rchIL-2为抗原制备了单克隆抗体和多克隆抗体，建立了检测rchIL-2含量的抗原捕获ELISA，探讨了天然chIL-2蛋白的体外表达动力学。非变性条件下纯化的rchIL-2 (0.4 ng) 对Con A活化的鸡T淋巴细胞具有明显的增殖活性，而对鸭及鹅的T淋巴细胞无增殖活性。抗chIL-2多克隆抗体可完全中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白的生物学活性，而单克隆抗体无中和rchIL-2和天然chIL-2蛋白生物学活性的功能。这些研究结果证实，大肠杆菌表达的rchIL-2及其多克隆抗体拥有生物学功能，而获得的单克隆抗体不具有chIL-2的中和特性。 相似文献
13.
[目的]探索鸡白细胞介素-18（IL-18）在H9禽流感（AI）灭活油乳苗免疫中的免疫佐剂作用.[方法]从鸡脾淋巴细胞中克隆鸡IL-18基因,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达质粒pIL-18.将重组真核表达质粒pIL-18、H9亚型AI灭活油乳苗及其二者联合分别免疫14日龄SPF鸡,检测其细胞免疫和体液免疫水平,评价鸡IL-18在H9亚型禽流感灭活油乳苗中的免疫增强作用.[结果]成功克隆了鸡IL-18全基因,大小为597 bp.质粒pIL-18和H9亚型AI灭活油乳苗联合免疫的SPF鸡所产生的HI抗体效价在接种第4周后明显高于H9亚型AI灭活油乳苗免疫组;其T淋巴细胞的增殖反应也强于H9亚型AI灭活油乳苗免疫组.[结论]质粒pIL-18能提高H9亚型禽流感灭活油乳苗诱发的免疫应答,为研究防制禽流感的新型疫苗提供了新思路. 相似文献
14.
鸡α干扰素/白细胞介素2基因的融合表达及活性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】研究高效广谱鸡基因工程重组复合抗病毒制剂以对鸡的病毒性疾病进行防治。【方法】采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过一基因柔性接头将鸡α干扰素(chicken interferon alpha,ChIFN-α)与鸡白细胞介素2(chicken interleukin-2,ChIL-2)基因构建成ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因并克隆入pGEM-T Easy载体,将嵌合基因亚克隆入pQE-30表达载体中进行原核表达。通过尿素变性、低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤对表达的重组融合蛋白(rChIFN-α-linker-ChIL-2)进行纯化。采用细胞病变抑制法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在细胞上抑制水泡性口炎病毒(VSV)和传染性法氏囊病毒(IBDV)增殖活性。采用ChIL-2ELISA试验方法检测rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白与抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应的活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚上对新城疫病毒(NDV)和禽流感H9N2亚型病毒(AIV H9N2)的抑制活性以测定其在鸡胚内抗病毒活性。分别测定rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内对NDV活疫苗和灭活疫苗的免疫增强作用以测定其在鸡体内的活性。【结果】成功构建并克隆了ChIFN-α-linker-ChIL-2嵌合基因。嵌合基因在大肠杆菌中表达的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白分子量大小约35.9kD,蛋白经纯化后纯度在96%以上。rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在CEF细胞上具有明显抗病毒活性,其抗VSV和IBDV活性明显高于单一rChIFN-α的抗病毒活性;rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白可以和抗ChIL-2单抗发生特异性免疫反应。IFN-α活性单位为200IU的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在SPF鸡胚内可明显降低NDV和AIV H9N2所引起的鸡胚死亡和胚体出血,并能显著延长鸡胚存活时间,但过高剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白抑制鸡胚死亡和出血能力有所下降。合适剂量的rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内具有显著的抗病毒活性和免疫增强活性。【结论】rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白在鸡体内外均具有ChIFN-α和ChIL-2蛋白的双重生物学活性,这为进一步研究以rChIFN-α-linker-ChIL-2蛋白为主要成分的基因工程抗病毒制剂在鸡体内抗病毒活性研究奠定了基础。 相似文献
15.
白细胞介素18和鸡白细胞介素18 总被引：8，自引：0，他引：8
白细胞介素 18是一种新发现的细胞因子 ,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌。目前在分子水平上已经证明 ,人、哺乳动物和某些鸟类中都有 IL- 18存在。IL- 18在结构上属于 IL- 1家族 ,在功能上它与 IL- 12相似 ,且二者有协同效应。 IL- 18具有多种生物学功能 ,它不仅可以增强 Th1型免疫反应 ,而且在 Th2型免疫反应中也发挥一定的作用。人类医学研究证明 IL- 18在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。在集约化畜禽养殖业中 ,包括白细胞介素 18在内的细胞因子作为天然的免疫调节剂 ,目前已被公认为是一种可以替代传统疗法的新型治疗剂。鸡 IL- 18基因是最近才被发现的 ,由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能 ,因而鸡 IL- 18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。 相似文献
16.
[目的]为深入研究鸭IL-18的基因表达及其生物学活性和分子佐剂的应用奠定基础。[方法]依据GenBank中香港鸭IL-18基因的序列设计1对特异引物,以广东水鸭脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆广东水鸭IL-18基因并进行序列分析。[结果]测序结果表明,广东水鸭的IL-18基因开放阅读框为603 bp,编码201个氨基酸,分子量为23.2 kDa。序列分析表明,所获得的广东水鸭IL-18基因与GenBank中香港鸭的核苷酸同源性为98.2%,氨基酸同源性为100%。它与鸡和火鸡的核苷酸同源性分别为86.9%和87.1%,而氨基酸同源性分别为96.5%和97.0%。[结论]进化树分析结果表明,鸭IL-18基因与鸡和火鸡进化关系较近。 相似文献
17.
18.
基于线粒体COⅠ基因15个鸡种的DNA编码研究 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】探明地方鸡种与引进鸡种遗传多态性特点,探讨COⅠ这一特定基因的特定区段作为DNA条形码在识别鸡种方面的可行性和有效性。【方法】以13个中国地方鸡种和2个国外引进品种为研究对象,利用DNA测序技术测定了线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidaseⅠ,COⅠ）基因部分序列。【结果】选择的这段COⅠ基因序列有38个突变位点,15个鸡种单倍型多样度平均为0.963,核苷酸多样度平均为0.00518,其中引进鸡种明显低于地方鸡种（除藏鸡外）;15个鸡种品种间Kimura双参数遗传距离为0.056%—0.917%,种内遗传距离为0—0.346%,15个鸡种的DNA分类和形态学分类基本一致,引进鸡种与地方鸡种分歧较远。【结论】利用线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ（COⅠ）这一特定基因的特定区段来做DNA条形编码的基础,进行不同鸡品种鉴定,具有可行性和有效性。 相似文献
19.
为了探索鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18(IL-18)的免疫增强作用,通过PCR和酶切方法将NDV F基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA-F。用质粒pcDNA-F单独或与鸡IL-18重组真核表达质粒pIL-18联合免疫14日龄SPF鸡。首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用NDV强毒F48E9株进行攻击。结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了50%免疫保护,这为ND的防治开辟了新的途径。 相似文献
20.
试论四级种子生产程序的理论基础 总被引：3，自引：0，他引：3
在种子生产过程中,影响品种群体的遗传稳定性因素很多,但四级种子生产程序都可以降低到最低限度。有效地保持了品种群体的遗传稳定性,成为种子生产中比较成熟的良繁技术路线。 相似文献