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研究表明，肠毒素是ETEC致幼畜腹泻的根本原因，由ETEC产生的肠毒素包括热敏感肠毒素（LT）和热稳定肠毒素（ST），其中ST又包括STⅠ和STⅡ。调查表明，几乎所有的腹泻幼畜只要分离到ETEC．大部分都产生STⅠ。但是，由于STⅠ的分子质量太小，几乎没有免疫原性，因此，通过基因融合的方式借助大分子物质提高STⅠ的免疫原性是当前国内外学者致力于ETEC疫苗开发的重点。轮状病毒系呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus）的成员，是致幼畜病毒性腹泻最主要的病原体，其中外膜蛋白VP4不仅是轮状病毒血清学分型的依据，而且是主要的保护性抗原。 相似文献
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轮状病毒(rotavirus,RV)是引起全球婴幼儿及幼畜非细菌性胃肠炎的主要病原体之一,VP4蛋白是轮状病毒的主要中和抗原。利用载体RD-BmBacmid与重组载体pBacPAK8-VP4共转染家蚕细胞BmN获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP4,并用该病毒感染BmN细胞及家蚕5龄幼虫,从而在BmN细胞及家蚕中表达TB-Chen株轮状病毒的VP4蛋白。Western blotting检测到BmN细胞及家蚕幼虫血淋巴中均出现88 kD的特异性条带,证明VP4蛋白在BmN细胞和家蚕中获得了表达。ELISA检测结果显示,VP4蛋白在BmN细胞和家蚕幼虫血淋巴中的表达分别在感染后4 d和6 d达到最高水平,每个细胞和每mL血淋巴中的表达量分别为4.28 pg和1.61μg。研究结果为轮状病毒口服疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为获得狂犬病病毒（RV）核蛋白抗原，采用RT—PCR方法从狂犬病病毒ERA株中扩增了RV核蛋白基因，分别亚克隆到原核表达载体pET-28a（＋）和pET-32a（＋）中，经PCR和双酶切鉴定以及序列测定，重组质粒构建成功。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，表达的核蛋白再经Ni^2＋-NTA亲和层析纯化。结果显示，核蛋白在pET-32a（＋）中的表达量（30．4％）高于在pET-28a（＋）中的表达量（19．4％），培养物中的高纯度核蛋白产量分别为13．6和8．45mg／L。经Western—blotting检测，不同载体表达的核蛋白均可被兔抗RV多克隆抗体特异识别，表明核蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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轮状病毒(rotavirus,RV)是引起婴幼儿和多种幼龄动物非细菌性腹泻病的主要病原之一,全世界每年因该病所引起人和动物死亡数量众多,并造成了巨大的经济损失。因此,世界卫生组织呼吁将RV疫苗的研制列为最优先发展的疫苗项目之一。对RV的分子生物学研究进展进行了综述,旨在为更好地开展轮状病毒相关基因的实验室研究提供基础。 相似文献
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用直接电镜（EM）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和ELISA检测了35份幼兔腹泻粪便样品，从中发现了轮状病毒（RV）抗原和RVRNA，并见到了典型的完整RV粒子，从而首次在国内检测出兔RV。新检测出的两株兔RVRNA电泳型为4、2、3、2，短型，归属于A组RV的第Ⅰ亚组。 相似文献
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轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起婴幼儿和幼龄动物急性腹泻和死亡的重要病原体,占所有肠道感染病因的50%以上,在全球已成为一项重要的公共卫生问题.发展RV疫苗、预防RV性腹泻是刻不容缓的任务.然而当今的侯选疫苗并不能达到预防所有RV胃肠炎的目标. 相似文献
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以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析.结果表明,在MRS培养基中加入1％甘氨酸+0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3～4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA. pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性. 相似文献
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A群猪轮状病毒VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
To prepare the monoclonal antibodies against VP7 protein of group A porcine rotavirus (PoRV) serotype G11,VP7 gene of PoRV serotype G11 was cloned into the vector pGEX-6P-1. The recombinant plasmid was transformed into E.coli competent cells DH5α and induced by IPTG. Hybridomas were produced by fusing SP2/0 cells with spleen cells from mouse immunized with GST-VP7 recombinant protein. One hybridomas secreting MAb against VP7 protein was identified by indirect ELISA. Western blotting analysis showed that the MAb could recognize the recombinant VP7 protein and authentic VP7 protein of PoRV，and the specific immunoflurescence was detected in PoRV infected MA104 cells by indirect immunoflurescence assay.The result of MTT method showed that the MAb had the neutralizing activity. The subtype of the MAb was IgG2b. The results showed that VP7 protein was successfully expressed in E.coli， one MAb was preparated and identified，and it could be used for further study of prevention，diagnosis and treatment of porcine rotavirus disease. 相似文献
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本研究的目的是以干酪乳杆菌 Ｌ． ｃａｓｅｉ ３４１０３染色体 ＤＮＡ为模板,利用 ＰＣＲ技术扩增出胸苷酸合成酶（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ, ｔｈｙＡ）基因,利用玻璃奶回收纯化试剂盒回收纯化ｔｈｙＡ基因,并将其克隆入以红霉素抗性为选择压力的可以在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的质粒ｐＷ４２５ｅ,再转化Ｘ５１感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定、ＰＣＲ扩增鉴定,并对ｔｈｙＡ基因片段进行测序,与已知序列进行同源性比较,结果表明成功克隆了 ｔｈｙＡ基因,全长约 １．１ｋｂ,与国外报道的 ｔｈｙＡ基因同源性达９９％。这为构建以ｔｈｙＡ基因为选择压力的非抗生素抗性穿梭表达载体奠定了基础。 相似文献
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猪轮状病毒地方株JL94株VP6基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
以猪轮状病毒地方分离株JL94株病毒核酸为模板,通过RT-PCR扩增内衣壳蛋白基因VP6 cDNA,将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序。从T载体上将VP6基因亚克隆到表达载体质粒pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并利用Ni^2 金属螯合亲合层析纯化融合蛋白。结果表明,VP6基因全长1356bp,并在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量可占菌体蛋白的26．5％,在表达的蛋白中,除45ku主要蛋白外,还有几条分子量较小的蛋白表达出来,这些融合蛋白经纯化后均具有良好的反应特异性。 相似文献
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为了研究猪A组轮状病毒VP7基因功能,根据GenBank中猪轮状病毒VP7基因DNA序列设计引物,以实验室轮状病毒上海分离株SH-1为模板,进行PCR扩增,将VP7基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码326个氨基酸,其相对分子量为37.38 Ku,理论等电点(PI)为4.77。VP7蛋白以α螺旋为主,主要有13个抗原表位区域。系统进化树分析显示分离株SH-1与KM230930.1株亲缘关系最近,基因型分析结果是G10型,属于人兽共患病毒株。 相似文献
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猪轮状病毒地方株JL94株VP4基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP4基因保守序列,利用Oligo4.1软件设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株VP4全基因序列;并将扩增产物与pMD-18T载体连接,经鉴定后将重组质粒进行测序并与国外分离株CRW-8株、BEN-307株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析.结果表明:JL94株和CRW-8株、BEN-307株VP4全基因片段核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型.本研究为进一步研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础. 相似文献
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采用重叠延伸PCR（SOE—PcR）方法通过一基因柔性接头（linker）将猪白介素2（PoIL-2）、6（PoIL-6）基因构建成PoIL-2linker-PoIL-6嵌合基因并克隆入pQE-30原核表达载体中进行融合表达;对表达的重组融合蛋白（rPoIL-2qinker-PoIL-6）进行纯化。分别检测rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应及促猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖活性。结果显示：成功构建了PoIL-2-linker-PoIL-6嵌合基因及其重组原核表达质粒（rpQE-30／PoIL-2-linker-PoIL-6）。表达的rPoIL-2linker-PoIL-6蛋白相对分子质量约28000,蛋白经纯化后纯度在96％以上。rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白分别具有与单一重组PoIb2、PoIL-6蛋白（rPoIL-2、rPoIL-6）对照相近的生物学活性,可与抗PoIL-2、PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并可显著促进猪外周血淋巴细胞和猪脾脏细胞的增殖。结果表明,rPoIL-2-linker—PoIL-6蛋白在体外具有单一rPoIL-2和rPoIL-6蛋白的双重生物学活性,这为下一步进行rPoIL-2-linker-PoIL-6蛋白在动物体内活性研究奠定了基础。 相似文献
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将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。 相似文献
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[目的]利用大肠杆菌原核表达系统对猪干扰素α-1(Po IFNα-1)基因进行表达,制备Po IFNα-1重组蛋白多克隆抗体。[方法]根据Gen Bank发表的Po IFNα-1核苷酸序列,合成密码子优化的Po IFNα-1基因,构建Po IFNα-1基因的p ET-28a原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌后,利用IPTG进行诱导表达。表达的Po IFNα-1重组蛋白纯化后,免疫昆明系小鼠,制备多克隆抗体。采用Western blot技术检测Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体与天然Po IFNα-1的反应性。[结果]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中成功表达,针对Po IFNα-1重组蛋白的多克隆抗体能够识别天然的猪干扰素α-1。[结论]合成的Po IFNα-1基因在大肠杆菌中获得了成功表达,为后续研究奠定了基础。 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2重组腺病毒的构建与鉴定及其免疫效果研究 总被引：5，自引：2，他引：3
为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,本试验根据GenBank中猪圆环病毒2型基因序列,设计了1对引物,用于猪圆环病毒2型ORF2基因的扩增。将目的基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ORF2。经PCR方法和限制性内切酶酶切法及测序证明该基因已成功连接后,重组腺病毒转移载体经PmeⅠ酶切线性化,在BJ5183细菌中与腺病毒骨架载体pAdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-CMV-ORF2。经PCR方法和PacⅠ酶切方法及测序鉴定表明该重组腺病毒载体已构建成功。PacⅠ酶切线性化pAd-CMV-ORF2,脂质体法转染AD293细胞进行病毒的包装和扩增。PCR及RT-PCR、IFA、Western blotting检测目的基因及其表达。结果表明,本试验成功构建了重组腺病毒pAd-CMV-ORF2。3次噬斑试验纯化重组腺病毒,测得其TCID50为10-8.75/0.1 mL。将重组腺病毒接种SPF级雌性BALB/c小鼠,用ELISA抗体检测试剂盒检测特异性抗体水平。小鼠免疫试验测得其特异性抗体水平较高,为PCV2重组腺病毒基因工程疫苗的进一步研究打下基础。 相似文献