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1.
《中国畜牧杂志》2019,(9)
本实验利用PCR方法扩增1株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)源的内切葡聚糖酶基因(CMCase),插入到p ET32a(+)中构建重组表达大肠杆菌系统,对重组内切葡聚糖酶基因进行生物信息学分析以及酶学性质研究。结果表明:内切葡聚糖酶由499个氨基酸组成,预测分子量为55.02 ku,最大开放阅读框ORF约为1 500 bp。经诱导表达优化后,培养上清中可检测到内切葡聚糖酶酶活力为5.81 IU/mL,菌体中为1.61 IU/mL,诱导后原菌液直接超声破碎处理可达7.41 IU/mL,其酶活力为野生菌株的2.3倍。重组内切葡聚糖酶具有典型内切纤维素酶的特征,其最适酶反应温度和pH分别为50℃和6,在60℃条件下放置1 h相对剩余酶活力可保持在70%以上,在pH 6～10范围内可保持90%以上。Na~+、Mg~(2+)可以促进重组内切葡聚糖酶酶活力,而Co~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(2+)等金属离子以及表面活性剂SDS则具有较强的抑制作用。由此可见,本实验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了内切葡聚糖酶,且该酶主要进行分泌表达,具有一定的耐热性和良好的pH稳定性。 相似文献
2.
试验旨在解决农作物秸秆饲料化过程中，秸秆纤维素难降解、适口性差和营养价值低等问题。试验以玉米秸秆粉为唯一碳源，从堆砌秸秆的土壤中分离筛选出1株耐酸且具有高纤维素酶活性的菌株HSU-20SJ。经3,5-二硝基水杨酸法测定纤维素酶活性，利用形态学、生理生化和16S rDNA进行种属鉴定，通过分子克隆技术，构建内切葡聚糖酶的大肠杆菌异源表达系统。结果显示，菌株HSU-20SJ粗酶液酶活为3.23 U/mL，最适反应pH值为5.0。该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），从菌株HSU-20SJ基因组中获得内切葡聚糖酶基因eg20SJ，异源表达后获得重组酶，分子量约为55 kDa，粗酶液酶活为6.28 U/mL。研究表明，试验在获得耐酸、高纤维素酶活菌株基础上，实现了内切葡聚糖酶基因的异源表达，可为纤维素酶的规模化生产和应用提供参考。 相似文献
3.
《动物营养学报》2020,(3)
本试验旨在构建含内切葡聚糖酶基因的重组乳酸杆菌,研究其对秸秆植物性饲料的降解效果,为后期构建高效分解纤维素的工程菌奠定基础。从桑天牛(Apriona germari)体内分离出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),克隆其内切葡聚糖酶基因,通过酶切连接的方式将目的基因片段与启动子P_(32)、信号肽SP_(lp0373)、乳酸杆菌载体pLEM-415共同构建了内切葡聚糖酶分泌表达重组质粒pLEM-P_(32)SPNqm,并对重组乳酸菌酶学性质和其在秸秆饲料中的降解能力进行测定。结果表明:从枯草芽孢杆菌中克隆出的目的基因大小为1 490 bp,构建的重组乳酸杆菌其表达产物的蛋白大小约54 ku。进一步测定发现,重组乳酸杆菌产酶最适温度和时间分别为37℃、24 h,在最佳条件下其羧甲基纤维素酶(CMCase)活性为2.06 U/mL。酶促反应最适温度和pH分别为60℃、6.0。在50～70℃、弱酸性条件下该酶的稳定性较好。金属离子Na~+、K~+、Mn~(2+)对酶促反应有促进作用,而Mg~(2+)、Cu~(2+)对酶活性抑制作用较大。重组乳酸杆菌发酵粗饲料,对玉米秸秆、苜蓿秸秆、小麦秸秆均发挥了一定的降解作用,中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维相对降解率分别为10.42%、21.12%,4.99%、7.85%,4.57%、9.53%。综上,本试验构建的重组乳酸杆菌对常见的秸秆植物性饲料均有一定的降解能力。 相似文献
4.
5.
本试验旨在构建不同纤维素酶的融合表达系统及探讨融合纤维素酶的酶学性质。利用PCR技术从实验室前期分离的枯草芽孢杆菌中分别扩增2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,设计一段柔性接头(GSGGGS),通过酶切连接将2个纤维素酶基因构建在一个开放阅读框(ORF)内,插入到pET32a(+)中构建重组表达载体pET32a(+)-Cel42-Cel22,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并对其酶学性质进行研究。结果表明:本试验成功克隆了2个纤维素酶基因Cel42和Cel22,并构建了重组表达系统BL21(DE3)/pET32a(+)-Cel42-Cel22,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)估计其分子质量约为101 ku,粗酶液中葡聚糖内切酶活性为57.62 U/mL,葡聚糖外切酶活性为32.57 U/mL。试验所得融合纤维素酶Cel42-Cel22的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6.0,温度在30~70℃范围内时可维持70%以上的纤维素酶活性,pH在4.0~9.0范围内时可保持75%以上的纤维素酶活性,除Mn~(2+)外的其他金属离子对纤维素酶的活性均具有一定的抑制作用,其中Hg~(2+)和Cu~(2+)对的抑制作用较明显。由此可见,本试验在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出了融合纤维素酶Cel42-Cel22,且该酶具有一定的活性,可适应较宽广的温度和pH范围,对金属离子敏感。 相似文献
6.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(23)
为了研究桦剥管菌木材纤维素降解机制,试验分别于23℃和28℃培养桦剥管菌,用菌落直径比较生长速度;以白桦木屑、云杉木屑和麦麸为底物诱导培养,以不加木屑的马铃薯液体培养基为对照,测定12 d内桦剥管菌在纤维素外切酶和纤维素内切酶两种纤维素酶活变化;以云杉木屑、白桦木屑、玉米秸秆和麦麸为诱导物,测定15~21 d内木聚糖酶和甘露聚糖酶两种半纤维素酶活变化;检测8种不同金属离子以及金属离子抑制剂EDTA对两种半纤维素酶活性的影响;并对白桦木屑诱导桦剥管菌产半纤维素酶的酶学性质进行了初探。结果表明:桦剥管菌菌丝更适合在28℃培养;纤维素外切酶和纤维素内切酶的最适底物分别为白桦木屑和云杉木屑,木聚糖酶和甘露聚糖酶最适底物分别为麦麸和玉米秸秆;两种半纤维素酶的最适反应温度均为50℃,最适反应pH值分别为5.0和6.0;8种金属离子中,仅Co2+对两种半纤维酶活性均有促进作用,EDTA对两种酶活性均具有较强抑制作用。 相似文献
7.
为提高纤维素的利用率,寻找到安全性能好、产酶效率高的菌株添加剂添加到饲料中,以提升动物对饲料的利用率,从牦牛瘤胃中分离高产纤维素酶菌株,进行16S rDNA的鉴定,并探究其在不同温度、pH、接种量和发酵阶段产内切型-β-葡聚糖酶、外切型-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的特性。结果表明：通过形态学鉴定以及16S rDNA基因序列测定,最终确定高产菌株M1为克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）。M1产内切型-β-葡聚糖酶活性大于外切型-β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶;M1在35℃、pH为7、接种量为2%的条件下产内切型-β-葡聚糖酶的效率最高,在30℃、pH为6、接种量为2%的条件下产外切型-β-葡聚糖酶的效率最高,在30℃、pH为6、接种量为1%条件下产β-葡萄糖苷酶的效率最高;在M1生长过程中,先产生了β-葡萄糖苷酶,其次是外切型-β-葡聚糖酶、内切型-β-葡聚糖酶,并且外切酶活性远远大于内切酶和β-葡萄糖苷酶活性。 相似文献
8.
研究旨在比较4种不同来源木聚糖酶基因在大肠杆菌E.coli BL21中表达后的酶活等性质,为生产中筛选高表达量及耐极性木聚糖酶基因提供依据。根据已发表的木聚糖酶基因序列设计引物,分别扩增出浸麻芽孢杆菌(B.macerans)B3、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)B6、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)B10和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)B12的木聚糖酶基因片段,经克隆表达后获得4种工程菌。经培养和IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳检测及酶特性分析。测序结果表明,4个基因的开放阅读框均为642 bp。其中前3种木聚糖酶基因均为首次报道。4种重组木聚糖酶在55℃下的酶活分别为:36.16、3.85、7.22、98.98 U/ml。4种重组木聚糖酶的最适反应温度均在50~60℃,且枯草芽孢杆菌木聚糖酶最为耐热。结果提示,枯草芽孢杆菌来源的木聚糖酶具有较高的酶活和较好的耐热性。 相似文献
9.
桑青枯病是一种土传性细菌病害,其病原为青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。内切葡聚糖酶(EGL)是青枯劳尔氏菌在胞内合成后分泌、吸附于细胞壁周围的一个重要毒力因子,研究以其为靶标的桑青枯病快速检测诊断技术,可以为病害防控提供技术支持。从青枯劳尔氏菌G12-50菌株中克隆了egl基因,将青枯劳尔氏菌与土壤常见的4种细菌以及植物常见的4种病原细菌的内切葡聚糖酶进行氨基酸序列多重比对,其同源性较低。构建重组质粒p ET32a-EGL转化大肠杆菌BL21融合表达EGL蛋白,制备的抗EGL多克隆抗体经ELISA检测其效价达1∶20 000,Western blot分析亦呈现单一的特异性条带。用制备的抗体对培养的青枯劳尔氏菌G12-50菌液和感染桑青枯病的桑茎汁液进行Western blot检测,结果出现明显的特异性条带,而对照大肠杆菌则没有出现条带。研究结果表明,青枯劳尔氏菌的内切葡聚糖酶可以作为桑青枯病早期检测诊断的病原靶标,直接应用于对桑园土壤和桑树样品的快速检测。 相似文献
10.
从棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536中克隆获得一个葡聚糖酶基因Glu1,其cDNA全长984bp,编码327个氨基酸。该葡聚糖酶属于Glyco-hydro-12家族,推测为β-1,4-葡聚糖酶,与深绿木霉IMI 206040的Glycohydro-12家族蛋白(XP_013940397.1)有91%相似性,且亲缘关系较近。运用qRT-PCR技术检测9种诱导条件下棘孢木霉Glu1基因的表达水平,结果表明,Glu1基因能参与棘孢木霉对山新杨(Populus davidiana×P.alba var.pyramidlis)或杨树病原菌的识别。构建原核表达载体并获得重组蛋白rGlu1。酶活特性分析结果表明,该酶最适pH为4.5,最适温度为45℃,且酶活性随诱导时间延长逐渐升高,在5h达到稳定。 相似文献
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12.
该试验以黄色瘤胃球菌基因组为模板,通过PCR扩增获得目的基因xynB,将xynB与表达载体PET28a连接,获得重组载体PET28a-xynB。用IPTG对含有重组载体的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,镍离子层析柱纯化后检测其酶学性质。生物信息学分析表明,XynB理论大小为47 kDa,预测等电点为4.49,不含信号肽,含有1个糖苷水解酶11家族结构域和1个碳水化合物结合结构域。酶学性质研究结果表明,该酶的最适pH值为5.0,最适反应温度为40℃,金属离子Mg2+、Na+、K+和Ba2+对木聚糖酶XynB有较好的激活效果。综上可知,黄色瘤胃球菌木聚糖酶XynB属于GH11家族,最适pH值为5.0,最适温度为40℃,酶比活力为62.94 U/mg。 相似文献
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鸡源大肠杆菌TEM-57型β-内酰胺酶基因的原核表达及酶特性 总被引：1，自引：0，他引：1
对该临床菌株进行接合试验,采用PCR扩增获得blaTEM-57基因片段,定向克隆入表达载体pET-28a构建重组质粒,经酶切和DNA测序鉴定后进行诱导表达,用双紫外分光光度仪测定表达蛋白的底物水解特性和抑制剂的抑酶特性.结果显示,耐药质粒成功从供体茵接合转移到大肠杆菌C600,接合子对青霉素类及氨基糖苷类药物耐药.PCR扩增产物电泳出现blaTEM-57目的条带.重组质粒经EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ双酶切及测序鉴定后,显示pET-28α/TEM-57原核表达载体构建成功.原核表达的最优条件为IPTG浓度0.8 mmol/L、温度37℃、诱导时间4h.blaTEM-57能水解氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢噻呋钠、头孢曲松钠、头孢噻肟钠及头孢哌酮,对头孢氨苄的Km最小为2.4,对头孢噻呋钠的Km最大为121.5;抑制剂舒巴坦钠和他唑巴坦对blaTEM-57水解抗生素有不同程度的抑制作用.pET-28α/TEM-57重组质粒得到成功构建和诱导表达,为进一步研究酶的其他特性及制备特异性的单克隆抗体奠定了基础. 相似文献
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芽孢杆菌中性植酸酶基因的原核表达及酶学性质分析 总被引：1，自引：0，他引：1
植酸酶作为饲料添加剂能够有效提高动物对饲料中磷的利用率及减少粪便中磷排放对环境的污染,并降低植酸的抗营养作用。为了获得性能稳定的高活性植酸酶,采用PCR扩增芽孢杆菌(Bacillus sp.)中性植酸酶基因phyC(GenBank登录号:FJ986327)的成熟肽编码序列,将其克隆进原核表达载体pET-28a(+),并转化E.coli BL21(DE3)进行表达。在37℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导4 h能够获得大量包涵体蛋白,在25℃条件下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h有利于可溶性蛋白的获得。利用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组植酸酶产物,获得的中性植酸酶的部分酶学特性为:耐热性较好,最适反应温度55℃,在70℃处理10 min可保持20%以上的酶活性;耐酸、碱能力较强,最适pH 6.0～7.0,pH 5.5～9.0时能保持80%以上的酶活性,pH 5.0～10.0时处理60 min仍能保持70%以上的酶活性,在pH 2.0～4.0时能保持40%以上的酶活性。利用构建的切除芽孢杆菌中性植酸酶基因phyC信号肽编码序列的原核表达载体及优化的诱导表达条件,能够在大肠杆菌中高量表达性能稳定的芽孢杆菌中性植酸酶。 相似文献
15.
本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。 相似文献
16.
《畜牧与兽医》2016,(3):37-42
姜苗营养丰富,但作为饲料存在粗纤维含量高而消化吸收率低的难题。内切β-葡聚糖酶主要由真菌代谢产生,可有效降解纤维素中的葡聚糖。本研究在单因子条件的基础上,探讨应用Plackett-Burman和中心组合设计等方法得到嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var.levisporus)固态发酵姜苗生产β-葡聚糖酶的最适发酵条件。结果表明,最佳培养基组成是姜苗70%(w/w)、豆粕30%(w/w)、初始含水量61.0%、尿素1.70%(w/w),KH2PO40.13%(w/w),Ca Cl20.1%(w/w)(固体培养基的总量)。在上述培养基中50℃培养72 h,β-葡聚糖酶活力可达682.8 U/g,与原始培养条件相比酶活提高了51.2%. 相似文献
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将来源于藏猪粪便的枯草芽孢杆菌BY-4菌株接种于含4%麸皮的产酶培养基中,37℃、220r/min培养48h,发酵上清液经HiTrap Phenyl HP疏水作用层析、HiPrep 16/60Sephacryl S-100凝胶过滤层析分离纯化得到一个内切葡聚糖酶组分,纯化倍数为15.5,回收率为25.0%。经SDS-PAGE、酶谱分析鉴定,两步分离纯化后为电泳纯的纤维素酶,相对分子量约为55 000。酶学性质研究表明,该酶的最适反应pH为4.5,最适反应温度为60℃。Mg2+、Zn2+对该酶有一定的激活作用,而Mn2+、Co2+、Ag+对该酶产生了抑制作用。 相似文献
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瘤胃厌氧真菌木聚糖酶基因的表达与酶学特性研究 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在表达来源于瘤胃厌氧真菌基因组的4个木聚糖酶基因A、C、D和F,并比较分析其酶学特性。首先根据大肠杆菌基因编码偏好,合成可在大肠杆菌中表达的木聚糖酶基因序列,然后采用同源重组的方法将各序列分别插入载体pET-28a中,在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中异源表达,并研究其酶学特性,结果成功表达出来源于厌氧真菌的4个木聚糖酶基因。测定其酶学性质发现,4种木聚糖酶的反应最适pH值均为8.0;木聚糖酶D的反应最适温度为37℃,其余3种木聚糖酶的反应最适温度均为45℃;4种木聚糖酶具有广泛的温度稳定性和pH稳定性;金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+显著促进木聚糖酶活性(P<0.05),而Zn2+则有明显的抑制作用(P<0.05);4种木聚糖酶降解山毛榉木聚糖的能力显著高于其他底物(P<0.05)。本研究成功表达了4种来源于厌氧真菌的木聚糖酶,其良好的温度和pH稳定性具有潜在的工业应用价值。 相似文献
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淀粉液化芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达 总被引：6，自引：0，他引：6
提取淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyrlolique faciens)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4葡聚糖酶基因全长。结果显示，该基因全长843 bp，ORF为717 bp，编码239个氨基酸，计算相对分子质量为26800，等电点为6．07。经Blast分析，该序列与基因库中的淀粉液化芽孢杆菌(M15674)同源性最高(97％)。该基因已被GenBank接受(AY205562，1)。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切目的片段和表达栽体pET-30a( )后相连接，构建了重组表达栽体pETamy，并导入BL21细菌中表达，酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在26000左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达90．74U／mL，是出发菌的3倍，最适温度在60℃左右，pH值在4～10之间。该工程菌可作为酶活高的理想材料，用以构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。 相似文献
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旨在验证直接电穿孔重组蛋白PhiC31能否在鸡DF-1细胞中诱导PhiC31介导的基因盒交换。本研究通过原核表达和经亲和层析纯化获得SUMO-His-PhiC31融合蛋白，利用SUMO酶切除SUMO-His标签，获得天然的PhiC31蛋白。这两种蛋白先与pBCPB+质粒在试管内共孵育进行分子重组反应。之后，先将带有attPTT-DsRed2-attPCT片段的“着陆点”(landing pad, LP)质粒通过电穿孔导入DF-1细胞，然后进行第二次电穿孔，将带有attBTT-EGFP-HiBiT-attBCT的donor质粒连同PhiC31蛋白导入上述DF-1细胞，验证DsRed2-EGFP基因盒交换事件发生。结果显示，成功构建了原核表达载体pET-28a-SUMO-PhiC31,经IPTG诱导，该重组质粒在大肠杆菌中以可溶性方式表达SUMO-His-PhiC31融合蛋白，经亲和层析纯化，SUMO-His-PhiC31蛋白的产量达12 mg·L-1;该融合蛋白和切除SUMO-H... 相似文献