共查询到20条相似文献，搜索用时 546 毫秒
1.
从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
2.
为进一步研究MHCI类分子作用机制,以及为制备MHCI基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHC Ⅰβ2m-a融合基因进行原核表达.运用RT-PCR方法,克隆鸡MHC Ⅰa和β2m链基因,并通过编码连接肽(Gly4 Ser).的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHC Ⅰβ2m-a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coliBL2 Ⅰ细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物.结果表明,成功克隆了MHCⅠa和β2m链基因,长度分别为1014和300 by;构建的融合基因MHCⅠβ2m-a长度为1194 by,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性. 相似文献
3.
本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子（MHCⅠ）重链（α链）胞外区与轻链（β2m）成熟肽的重组嵌合分子。采用RT—PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列；采用重叠延伸PCR（Splicing overlap extension PCR method，SOE-PCR）把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT—PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因，大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物，以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板，进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段；测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连，阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。 相似文献
4.
为进一步研究MHCⅠ类分子作用机制,以及为制备MHCⅠ基因工程疫苗奠定基础,克隆鸡MHCⅠ基因,并构建MHCⅠβ2m-α融合基因进行原核表达。运用RT-PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m链基因,并通过编码连接肽（Gly4Ser）4的基因序列将两者头尾相连,构建了pET-32a-MHCⅠβ2m-α重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组质粒在E.coli BL21细胞进行IPTG诱导表达融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting方法分别检测表达产物。结果表明,成功克隆了MHCⅠα和β2m链基因,长度分别为1014和300 bp;构建的融合基因MHCⅠβ2m-α长度为1194 bp,经原核表达,融合蛋白分子质量约为62.0 ku,能与相应的抗体结合,具有一定的免疫学活性。 相似文献
5.
从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。 相似文献
6.
为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。 相似文献
7.
β2微球蛋白（β2m）是组成主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子复合体的轻链分子,对于MHCⅠ类分子在细胞表面稳定表达和有效递呈抗原肽必不可少。本试验从来航鸡全血细胞中克隆了鸡β2m（Chβ2m）全基因,利用软件预测了其信号肽序列,并构建了表达成熟Chβ2m的重组载体,在大肠杆菌表达系统中以包涵体形式高效表达。将所得包涵体溶于8 mol/L脲,并在变性条件下对包涵体中的重组Chβ2m进行纯化,获得了高纯度的Chβ2m,为制备MHCⅠ四聚体及探索禽类MHCⅠ类分子结构与功能的关系提供了条件。 相似文献
8.
根据基因库中鸡β-防御素Gal-6cDNA基因序列设计2对引物,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从安徽三黄鸡白细胞RNA中扩增了β-防御素Gal-6cDNA基因片段。得到了大小为250bp片段。将扩增产物纯化并克隆到PGEM-T-Easy载体上,转化感受态细胞DH-5α,经筛选获得重组质粒并测序,用P3/P4引物从重组质粒中扩增出成熟肽,大小约150个bp。测序后Blast分析表明,安徽三黄鸡序列与基因库上已发表的序列相差一个碱基,Gal-6多肽共有67个氨基酸组成,分别是20个氨基酸残基的信号肽、5个氨基酸的原片段、42个氨基酸的成熟肽。 相似文献
9.
以猪A组轮状病毒mRNA为模板，应用优化的反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）技术，扩增了2331 bp的Vp4全长基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中，构建质粒pGEM-T-Vp4。以SalⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM—T—Vp4．和以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t，并将纯化的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425t中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp4。将pW425t-Vp4转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli X13中，通过生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87.67Ku融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性，研究结果为pW425t-Vp4在乳酸菌受体菌株中表达提供科学依据。 相似文献
10.
根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化E.coli DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化E.coli BL21(DE3) 感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1 ku左右,经0.2 mmol/L IPTG诱导3 h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。 相似文献
11.
为了构建山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因酵母表达载体,试验根据GenBank中鸡β防御素Gal-2基因序列设计引物,采用RT-PCR技术从山地乌骨鸡骨髓细胞中扩增出Gal-2基因,经PCR和酶切鉴定后测序,并采用DNAStar软件进行生物信息学分析;再根据毕赤酵母偏爱密码子和山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因序列设计并合成1对引物,采用PCR技术从重组质粒pMD18-T-Gal-2扩增出其成熟肽编码基因,并将其插入载体pPICZaA,构建重组质粒pPICZaA-Gal-2,将pPICZaA-Gal-2线性化,通过电击转入毕赤酵母菌株GS115,用1%甲醇诱导表达120 h,表达产物纯化后进行Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定。结果表明:山地乌骨鸡β防御素Gal-2基因克隆成功;山地乌骨鸡β-防御素Gal-2成熟肽编码基因重组真核表达载体构建成功;山地乌骨鸡Gal-2基因在酵母中得到表达。 相似文献
12.
据NCBI上已发表的序列设计引物,通过RT—PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到MHCⅡβ基因,将其克隆至pMD18-T载体上,经酶切分析及测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌BL21中诱导表达。蛋白纯化后,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,经1：100倍稀释后用于Westernblot分析。结果表明：克隆得到了鸭MHCⅡβ链基因,大小为798bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为92％;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度达95％。制备的鼠抗鸭MHCⅡβ多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验（ELISA）与免疫印迹法（Westernblot）证实抗体的效价高、特异性强,为深入研究鸭MHCⅡ奠定了基础。 相似文献
13.
为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。 相似文献
14.
本研究旨在克隆和表达猪肿瘤坏死因子成熟肽基因及其表达蛋白的生物活性。根据GenBank登录的猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)成熟肽基因序列设计一对上下游引物。应用RT-PCR技术直接从丹系长白猪脾脏组织中扩增猪的TNF-α成熟肽基因。将RT-PCR扩增到的特异性片段克隆到pGEM-T Easy载体中,构建pGEM-TNF重组质粒,经宝生物(大连)有限公司测序,该TNF-α成熟肽基因的长度为465 bp,编码154 aa。以重组克隆质粒pGEM-TNF为模板,PCR扩增猪TNF-α成熟肽基因,并将其插入原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌(E.coli)BL21中诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明表达的融合蛋白约为38 ku,重组蛋白以包涵体形式表达,表达重组蛋白约占菌体总蛋白的36.8%。细胞毒T细胞试验表明所表达的蛋白经初步纯化、变性复性后,可明显增强淋巴毒性T细胞作用。结果提示长白猪肿瘤坏死因子得到了成功克隆与表达,表达的蛋白产物具有一定的生物活性。 相似文献
15.
本研究以胞内分枝杆菌ATCC13950株基因组DNA为模板,应用巢氏PCR方法扩增热休克蛋白65(HSP65)基因,PCR产物经纯化后与PMD18-T载体连接构建克隆质粒PMD18-T-HSP65,并转化大肠杆菌感受态细胞DH5,筛选阳性克隆并测序,NdeⅠ和BamHⅠ双酶切PMD18-T-HSP65和表达载体PET15b,用T4连接酶4℃过夜连接,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS中,筛选和构建了原核重组表达质粒PET15b-HSP65,双酶切鉴定正确后,以终浓度为1mmol/LIPTG诱导并进行SDS-PAGE分析。结果表明,获得约65KD大小的蛋白,与预期结果相符,为胞内分枝杆菌及HSP65基因功能的研究打下基础。 相似文献
16.
为了克隆和田羊肌肉生长抑制素（Myostatin）蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank（登录号为NM001009428）中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a（+）表达质粒,进一步构建pET-28a（+）-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a（+）-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。 相似文献
17.
为了构建马MHCI四聚体分子，从马外周血单核细胞（PBMC）中提取总RNA，采用RT-PCR技术对去除信号肽部分的β2m基因进行了扩增，将其RT-PCR产物经纯化、BarnHⅠ＋XhoⅠ酶切后与经同样处理的原核表达载体pET-28a（＋）进行连接，转化入感受态细胞BL21（DE3）。将筛选出的阳性克隆进行测序、诱导表达并将其表达产物进行纯化。结果表明，去除信号肽部分的马β2m基因全长300bp，含有1个开放阅读框，编码一由99个氨基酸组成的成熟蛋白；表达产物以包涵体的形式存在，经SDS-PAGE和Western-blotting分析，重组蛋白的分子质量约为15ku，且具有免疫生物学活性。 相似文献
18.
根据GenBank中鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌贵州分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了鸡肠炎沙门氏菌ompA蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析结果表明, 该重组蛋白的分子质量约为55 ku,可溶性分析结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白具备免疫原性。 相似文献
19.
20.
用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-VpC,并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性. 相似文献