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《中国家禽》2017,(19)
为了开发鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒,研究利用灭活纯化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)FX2010株作为包被抗原,由瑞普(保定)生物药业有限公司连续制备了5批次鸭坦布苏病毒间接ELISA抗体检测试剂盒中试产品。该试剂盒对禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭细小病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒阳性血清和5份SPF阴性质控血清进行的检测均无交叉反应,表明具有较好的特异性。批内和批间重复性试验的变异系数为1.5%~4.2%和2.2%~5.3%,表明产品具有很好的稳定性。应用该试剂盒及中和试验对300份疑似DTMUV阳性血清样品进行检测,结果显示:二者阳性样品符合率为90.12%,阴性样品符合率为93.6%,总符合率为92.7%。研究结果表明,该试剂盒具有操作简便、敏感性高和特异性强的特点,可以为鸭坦布苏病毒病的快速诊断及其流行病学调查提供有力的工具。 相似文献
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以鹅源坦布苏病毒JS804毒株制备的多克隆抗体为捕获抗体,抗鹅坦布苏病毒NS1蛋白的单克隆抗体4A9作为检测抗体,建立了检测坦布苏病毒的双抗体夹心ELISA方法。该方法的最佳反应条件为:兔抗鹅坦布苏病毒多克隆抗体的最适稀释度为1∶1 600,单克隆抗体的最适稀释度为1∶160,样品反应时间为1 h,酶标羊抗鼠二抗工作浓度为1∶5 000,以OD450nm≥0.245作为阳性判定标准。该方法的板间、板内重复性变异系数小于10%,病毒最低检测量为386.25TCID50/0.1 mL,与新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭肝炎病毒(DHV)和鹅细小病毒(GPV)无交叉反应。应用该方法与RT-PCR方法同时检测22份临床样品,符合率达到86.36%。结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于坦布苏病毒的快速检测。 相似文献
3.
本研究用鸭坦布苏病毒病灭活苗三次免疫SPF蛋鸡,收取高免鸡蛋,制备成冻干高免卵黄抗体;用鸡胚中和试验和间接ELISA方法进行效价检测。试验结果显示,第3次免疫后2周,卵黄抗体中和效价为1∶103.5,4、5周达到最高值1∶104.5;间接ELISA方法检测冻干前后的抗体效价结果均为阳性;对鸭坦布苏病毒强毒的攻毒保护率达100%,可为鸭坦布苏病毒的防控提供一种有效的冻干高免卵黄抗体制剂。 相似文献
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为建立特异性和敏感性较高的鸭坦布苏病毒(DTMUV)抗体检测方法,采用原核表达系统对DTMUV E蛋白的DⅢ结构域进行了双串联融合表达,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白大小约25 Ku。Western blot结果显示,经亲和层析纯化的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组DⅢ蛋白作为包被抗原,初步建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA方法。采用梯度稀释法对ELISA各种反应条件进行优化,确定最适工作条件。重组抗原最适包被浓度为5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,兔抗鸭酶标抗体最适稀释度为1∶1000;抗体临界值S/P≥0.336判定为阳性,S/P≤0.287判定为阴性,介于两者之间为可疑。该方法检测禽流感病毒、鸭源新城疫、鸭甲肝病毒、鸭圆环病毒、鸭细小病毒、经典呼肠孤病毒及新型鸭呼肠孤病毒等血清均为阴性,4个批次批内与批间重复试验的OD值变异系数分别为6.21%~7.27%和3.4%~7.2%,显示该法具有很好的特异性、稳定性和重复性。用建立的间接ELISA与中和试验分别对108份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,两种方法的阳性符合率为83.3%。 相似文献
5.
为了检测鸭群中鸭坦布苏病毒的血清学流行情况,本研究在前期成功表达鸭坦布苏病毒NS1蛋白的基础上,建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法。棋盘法确定了当纯化的NS1蛋白包被量为0.188μg/孔,待检血清1:200稀释,HRP标记的兔抗鸭二抗1:16000倍稀释时反应条件最佳。在最佳反应条件下,阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒、鸭肝炎病毒、鸭疫里默氏杆菌阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6%和10%,显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测临床鸭坦布苏病毒感染鸭及攻毒蛋鸭的55份临床血清样品,测得52份为阳性,阳性率为94.5%,对36份阴性鸭群血清样品进行检测,36份为阴性,阴性率为100%。该方法为鸭坦布苏病毒的诊断和流行病学监测奠定了基础。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒间接ELISA抗体检测方法建立与应用 总被引：1，自引：0，他引：1
猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是目前引起我国猪急性肠炎并水样腹泻的重要病原之一,但尚无商品化病毒血清抗体检测试剂盒。本研究以纯化的PEDV为包被抗原,通过优化ELISA反应条件,建立了间接ELISA抗体检测方法,其反应条件为:抗原最佳包被浓度为3μg/mL,血清样品最佳稀释度为1∶100,包被时间为37℃作用2 h,1.5%BSA 37℃封闭3 h,二抗1∶10 000稀释,37℃作用30 min,抗体临界值为OD450nm≥0.306判为阳性,OD450nm≤0.268判为阴性,介于二者之间为可疑。该方法检测6份已知PEDV阳性血清效价为1∶3 200,检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒和口蹄疫病毒血清抗体均为阴性,批间和批内重复试验变异系数2.5%～8.3%,对江苏、上海、浙江、安徽地区587份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达56.76%,证明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2014,(23)
为了研究一种可同时检测鸭坦布苏病毒与鸭圆环病毒的二重PCR方法,试验采用DNASTAR及Primer Premier 5.0软件,针对Gen Bank中坦布苏病毒(DTMUV)E基因和鸭圆环病毒(Du CV)REP基因的保守序列,设计合成了2对引物,通过优化反应体系条件及特异性、敏感性评价,建立了鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的二重RT-PCR方法。结果表明:该方法对鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒的检测敏感性达到100 fg;使用该方法对新城疫病毒、鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合征病毒的检测结果全为阴性。说明建立的二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭坦布苏病毒和鸭圆环病毒感染的快速鉴别诊断。 相似文献
8.
为筛选出理想的鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗免疫佐剂,将灭活的坦布苏病毒液和禽流感病毒(H9亚型)尿囊液分别与白油佐剂、卡波姆佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂制成抗原含量相同的TMUV-AIV二联灭活疫苗。应用阻断ELISA方法和血凝抑制方法测定免疫鸭血清中坦布苏病毒和禽流感病毒抗体,比较不同佐剂疫苗对试验鸭的免疫效力。结果表明,以白油作为佐剂的灭活疫苗组免疫效果最好,抗体产生快、抗体水平优于其他各组,免疫2周后60%(6/10)血清样品HI抗体可达1∶8以上,80%血清样品呈TMUV抗体阳性,是制备鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗的理想佐剂。 相似文献
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《养禽与禽病防治》2016,(8)
为建立鸭坦布苏病毒抗体ELISA检测方法,采用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒ZJSBL01株E蛋白结构域III(EDIII)基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a,转化到BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得了重组EDIII蛋白。利用EDIII蛋白作为包被抗原,建立了检测DTMUV Ig G抗体的间接ELISA方法,并对反应条件进行优化。最终确定抗原包被浓度为4μg/m L、血清稀释度为1:40、抗原包被条件为37℃包被4 h、封闭液为含3%BSA的PBST、封闭条件为37℃封闭2 h、酶标二抗稀释度为1:1 000、底物反应时间为15min作为ELISA的最佳反应条件。当检测样品S/P大于0.306判定为阳性。建立的ELISA检测方法特异性强、重复性好,对开展鸭坦布苏病毒抗体检测及血清学调查具有重要意义。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状,目前尚无有效的血清学检测方法评价猪群疫苗免疫或感染后抗体水平与免疫保护力之间的关系。为建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法,本研究选择GP5蛋白亲水区进行原核表达,以表达的重组蛋白tGP5为包被抗原建立了检测针对GP5蛋白抗体的ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度2μg/mL,37℃包被2 h,5%脱脂乳37℃封闭2 h,待检血清稀释度1∶100,37℃作用1 h,二抗1∶20 000稀释,37℃作用45 min,37℃显色3 min,抗体临界值OD450nm≥0.22判为阳性,OD450nm<0.183判为阴性,介于两者之间为可疑。特异性和重复性试验证明,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性较好。 相似文献
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旨在建立一种新型可适用于鸭疫里默氏杆菌(RA)病抗体检测的间接ELISA方法。以血清2型RA贵州分离株为研究对象,将其微孔蛋白Proin编码的基因克隆至pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-32a-porin,在E.coli BL21(DE3)中使用IPTG诱导后表达。以纯化后的Porin蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化建立一种检测RA抗体的间接ELISA方法,对其性能进行综合评价。结果显示,该方法具有较好的敏感性、重复性及特异性,阳性血清经1∶6 400稀释后检测结果仍为阳性,批内变异系数(CV)在1.27%～4.90%之间,批间CV在2.59%～5.43%之间,该方法可特异性地检测出抗RA抗体,与禽流感病毒(AIV)H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)及E.coli阳性血清均无交叉反应,与商品化ELISA抗体试剂盒检测相比,两者符合率为97.26%。使用建立的ELISA方法对临床采集的801份样品血清开展抗体检测分析(626份为已免疫鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗“血清1型+血清2型”的样品血清,175份为未免... 相似文献
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《广东畜牧兽医科技》2015,(5)
为建立一种鸭坦布苏病毒(DTV)快速检测方法,根据Gen Bank上DTV基因组序列,设计1对特异性检测引物,建立了DTV一步RT-PCR检测方法。该方法检测基因A型鸭甲肝病毒、基因C型鸭甲肝病毒、新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒均为阴性。检测的敏感性达3.78 pg RNA。DTV一步RT-PCR检测方法特异性好、敏感性高、重复性好,可用于DTV的分子流行病学调查和临床疾病诊断。 相似文献
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《中国家禽》2016,(1)
研究旨在建立基于真核表达的鸭坦布苏病毒(DTV)E蛋白的诊断鸭坦布苏病毒病的间接ELISA方法。利用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫表达系统,构建含有DTV E基因的重组杆状病毒。用重组病毒感染昆虫细胞后,SDS-PAGE鉴定出55 ku左右的表达蛋白,Western blot检测该蛋白具有很好的反应原性。以重组Bacmid DTV E蛋白作为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。利用该方法对135份来自江苏省的樱桃谷鸭血清样品进行检测,发现其血清阳性率达79.3%。表明建立的间接ELISA检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可以用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断。 相似文献
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黄病毒E蛋白结构域Ⅲ能够介导病毒与宿主受体结合以及诱导产生中和抗体,本研究利用原核表达系统表达了鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ,并研究了其免疫原性。按照大肠杆菌偏好性密码子对鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ核苷酸序列进行优化并合成后,克隆至pCold-TF载体构建重组质粒pCold-TF-optiEDIII。Western blot证实重组蛋白能与鸭坦布苏病毒特异性血清发生反应。用纯化的重组蛋白免疫BLAB/c小鼠3次,间接ELISA和间接免疫荧光实验证实E蛋白结构Ⅲ诱导了鸭坦布苏病毒特异性的体液免疫反应。中和实验证实鸭坦布苏病毒E蛋白结构域Ⅲ可诱导产生中和抗体。本研究为进一步研制鸭坦布苏病毒诊断抗原和亚单位疫苗奠定了基础。 相似文献
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新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus, NGPV)是由鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)变异而来，可感染雏鸭，引起以鸭短喙侏儒综合征为主要特征的传染性疾病。2015年该病在我国鸭群中大暴发，严重影响鸭出栏率，给我国的养殖行业带来巨大的经济损失。为建立一种鸭源NGPV抗体的间接ELISA检测方法，用于鸭感染细小病毒的血清学检测和鸭免疫细小病毒疫苗后抗体水平监测，本研究利用生物信息学预测了NGPV YICH株的结构蛋白VP3的抗原表位，选择了抗原富集区域(aa250～525)进行原核表达，经蛋白纯化获得了可溶性的VP3截短蛋白VP3-tr。以VP3-tr为包被抗原，经过棋盘滴定方法优化各个反应条件，建立了NGPV抗体的间接ELISA检测方法。利用优化后的间接ELISA方法对30份GPV阴性鸭血清进行检测，确定阴阳性临界值为0.219。ELISA方法的灵敏性、特异性和重复性检测结果表明，该方法灵敏度较高，特异性良好，不与鸭坦布苏病毒、新城疫病毒、禽流感病毒、鸭疫里默杆菌、大肠杆菌病原阳性血清发生交叉反应；批内和批间重复试验的变异系数均小于6%,重... 相似文献
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鸭坦布苏病毒抗体间接ELISA检测方法的建立 总被引：7，自引：1，他引：7
为建立快速检测鸭坦布苏病毒(DTV)的血清学方法,本研究利用纯化的DTV奉贤株(FX2010)作为包被抗原,建立了检测DTV血清抗体的间接ELISA方法,并且对各种检测条件进行了优化。优化后确定的抗原最适包被浓度为1.675μg/孔,抗原最佳包被条件为37℃放置2 h后,4℃下过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000。在优化条件下,阴阳性临界值判定标准为0.432。用建立的间接ELISA方法对禽流感病毒、新城疫病毒、网状内皮增生病病毒、I型鸭肝炎病毒、呼肠孤病毒、禽白血病病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为2.9%和3.9%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接ELISA方法对140份疑似鸭坦布苏病血清样品进行检测,有108份样品呈现阳性,而琼扩试验只有32份呈阳性结果,而且用该方法检测的阳性样品包括了琼扩试验的阳性样品,证明该方法具有较高的敏感性和特异性。本研究快速检测DTV抗体间接ELISA的建立为该病的诊断和流行病学调查提供了新的方法。 相似文献
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《中国兽医学报》2017,(12)
为了明确持续低产蛋率开产蛋鸭群的主要病毒病感染情况,应用已建立的间接ELISA方法和血凝抑制试验对2013年1月至2015年10月采自福建、广东、广西、江西、浙江、江苏和安徽等7省(区)免疫过H5亚型和H9亚型禽流感灭活疫苗但未免疫禽1型副黏病毒病疫苗和禽坦布苏病毒病疫苗,表现为持续低产蛋率的29个开产蛋鸭群的4 737份血清样品进行抗体检测,同时采集蛋鸭卵巢组织进行RT-PCR检测。结果显示,29个开产蛋鸭群中,H5亚型禽流感、H9亚型禽流感、禽1型副黏病毒病和禽坦布苏病毒病抗体的群阳性率分别为100.0%,100.0%,10.3%和100.0%,群内阳性率分别为79.4%~100.0%,82.5%~100.0%,0.0%~13.1%和33.7%~100.0%;蛋鸭卵巢组织中H5亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、禽1型副黏病毒和禽坦布苏病毒的阳性率依次为13.8%(4/29),0.0%(0/0),3.5%(1/29)和86.2%(25/29)。上述结果表明,我国以上7省(区)表现持续低产蛋率的开产蛋鸭群存在禽坦布苏病毒的严重感染,应引起养鸭生产者的高度重视。 相似文献
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为建立特异性和敏感性高的检测鸭坦布苏病毒感染的方法,采用原核表达系统对鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因进行了克隆与表达,SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白大小为54.3 ku.Western blot结果表明,经亲和层析法纯化后的重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应.以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,初步建立了检测E蛋白抗体的间接ELISA方法.对ELISA各种反应条件进行了优化,确定了最适工作条件.优化后确定的抗原最适包被浓度为7 μg/mL,血清的最佳稀释度为1;320,酶标抗体最适稀释度为1:1 000.在优化条件下,阴性和阳性临界值判定标准为0.324 4.本研究建立的快速检测DT-MUV抗体的间接ELISA方法为该病的检测和流行病学调查提供了技术手段. 相似文献