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【目的】研究绵羊肝片吸虫(Fasciola hepatica,Fh)CatL1D蛋白的分子特征和免疫原性。【方法】利用RT-PCR技术扩增出CatL1D基因,用相关软件分析其编码蛋白的生物学信息。将CatL1D基因克隆入表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-CatL1D,进行BamHⅠ/XhoⅠ双酶切和测序鉴定。将pET-CatL1D载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE和Western blot分析;以纯化后的重组蛋白CatL1D为抗原免疫小鼠,利用间接ELISA方法检测抗体效价,分析其免疫原性。【结果】成功克隆了CatL1D基因,该基因全长981 bp,编码326个氨基酸,其中第21-79位氨基酸为组织蛋白酶前肽抑制剂结构域,第108-321位氨基酸为木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶保守结构域;CatL1D蛋白含有6个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、11个豆蔻酰化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点,含有10个优势抗原表位。成功构建了pET-CatL1D原核表达载体,诱导表达出CatL1D重组蛋白;SDS-PAGE和Western blot分析表明,重组蛋白CatL1D分子质量为51 ku,以包涵体的形式表达,具有较强的反应原性。间接ELISA法检测结果表明,重组蛋白CatL1D免疫小鼠血清抗体效价可达1∶102 400,证实其具有良好的免疫原性。【结论】Fh重组蛋白CatL1D具有较强的抗原性,有开发为早期诊断抗原和亚单位疫苗的潜力。 相似文献
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为研究肝片吸虫Ftn-1蛋白的免疫学特性,根据Gen Bank中已发表的Ftn-1基因序列设计特异性引物,以肝片吸虫总RNA为模板,进行Ftn-1基因的RT-PCR扩增,将扩增产物连接到p MD19-T载体中,筛选出阳性克隆后测序,分析其分子特征。将Ftn-1基因克隆入表达载体p ET-32a(+)中,将其转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达并获得纯化的重组蛋白Ftn-1,经SDS-PAGE检测后,进行Western blot和小鼠免疫试验,分析其抗原性。结果显示,成功克隆了肝片吸虫Ftn-1基因,其c DNA全长为477 bp,推测编码158个氨基酸,编码蛋白质分子的抗原表位区主要集中在第33—57、83—87、113—146位,为亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。经SDS-PAGE检测,重组蛋白Ftn-1分子质量约为33.5 ku,与预期大小相符;Western blot分析结果表明,重组蛋白Ftn-1可被肝片吸虫阳性血清特异性识别,证明具有良好的反应原性。小鼠免疫试验证实,重组蛋白Ftn-1具有良好的免疫原性。 相似文献
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OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化 总被引：2，自引：0，他引：2
构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。 相似文献
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为克隆并原核表达布氏杆菌(Brucella melitensis)疫苗菌株M5Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA,并进行表达蛋白的免疫原性分析,应用PCR技术从布氏杆菌疫苗菌株M5全基因组扩增RicA基因片段,亚克隆至pMD18-T载体后测序分析,构建重组表达载体pET-28a(+)-RicA,转化E.coli BL21(DE3)表达菌,以不同浓度IPTG诱导表达不同时间,SDS-PAGE鉴定表达效果,表达蛋白经AKTA蛋白纯化系统纯化,用Antheprot 5.0软件分析其理化特性及抗原性,Western Blot检测其免疫原性。结果表明:RicA基因全长528bp,编码175个氨基酸,与基因库中已知菌株的核苷酸同源性和氨基酸同源性均达到99%以上。SDS-PAGE表明,RicA融合蛋白在大约23ku处出现条带,纯化后条带单一。软件分析发现RicA蛋白融合抗原性较强,Western Blot检测证明其有较好的免疫原性。说明,成功克隆并表达布氏杆菌疫苗菌株M5 RicA基因,为进一步研究其与布氏杆菌Ⅳ型分泌系统及布氏杆菌致病机制之间的关系奠定了基础。 相似文献
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根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆SW分离株E2基因进行RT-PCR扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入华赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-E2。用SalⅠ酶切线性化重组质粒pPIC9K-E2,电转化酵母GS115,通过G418筛选重组酵母菌GS115-pPIC9K-E2,用φ=1.5%甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为23.2ku;Western blot分析表明,该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
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【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因(SmC4H)的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。 相似文献
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[目的]明确肝片吸虫组织蛋白酶B4(CatB4)的分子特征及其免疫原性,为研究肝片吸虫CatB4蛋白的生物学特性及揭示其致病机理提供科学依据.[方法]通过RT-PCR扩增肝片吸虫CatB4基因,利用在线分子生物信息学软件对CatB4基因及其编码蛋白进行分子特征分析;构建原核表达载体pET-CatB4,经IPTG诱导获得融合蛋白后进行SDS-PAGE和Western blotting检测分析;并以融合蛋白CatB4免疫小鼠制备多克隆抗体,利用免疫组化对融合蛋白在肝片吸虫体内的表达进行定位分析.[结果]肝片吸虫CatB4基因片段为699 bp,其编码蛋白等电点(pI)7.95,理论分子质量25.89 kD,无信号肽和跨膜区,属于非分泌性蛋白;CatB4蛋白存在10个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化位点和7个N-肉豆蔻酰化位点,有9个抗原决定簇,具有高度保守的CatB结构域,是由无规则卷曲连接9个α-螺旋和8个β-折叠构成其空间结构.基于CatB4基因核苷酸序列同源性构建的系统发育进化树显示,肝片吸虫和大片吸虫聚为一支,二者的同源性为83.98%.SDS-PAGE检测和Western blotting分析结果均显示在41.80 kD处能检测到目的条带.以纯化融合蛋白CatB4与弗氏佐剂乳化后免疫的小鼠均可产生特异性抗体,证实融合蛋白CatB4具有较强的免疫原性;免疫组化定位分析结果显示,在肝片吸虫的卵黄腺腺体细胞、排泄管上皮细胞、肠道上皮细胞和卵黄腺管上皮细胞均发生特异性的抗原抗体反应,呈深棕色.[结论]诱导表达获得的融合蛋白CatB4可特异性识别绵羊肝片吸虫阳性血清,具有较强的免疫原性,且主要在肝片吸虫分泌排泄组织器官中表达,说明CatB4蛋白具有作为肝片吸虫候选抗原的潜力. 相似文献
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水稻Os SSI2基因负调控水稻的抗病反应,为了研究该基因的抗性机理,构建p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体,转化大肠杆菌BL21细胞后利用IPTG诱导外源蛋白表达并优化表达条件,使用SDS-PAGE和Western Blot检测分析表达产物。结果表明:成功构建了p GEX-6P1-Os SSI2原核表达载体后进行原核表达,在IPTG浓度为0.3 mmol/L,温度为25℃,诱导表达7 h,通过SDS-PAGE和Western Blot检测发现Os SSI2蛋白的可溶性表达量最多,为进一步研究水稻Os SSI2蛋白的抗性机理奠定了基础。 相似文献
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根据犬弓首蛔虫(Toxocara canis)黏蛋白2的基因组数据(GenBank:AF167707),以T.canis成虫的基因组DNA为模板扩增Tc-muc-2基因并进行序列分析;同时构建Tc-muc-2/pCold TF原核表达载体,采用ITPG诱导表达,对重组蛋白进行纯化并制备多克隆抗体.结果显示Tc-muc-2基因全长序列为549 bp,共编码183个氨基酸;多重序列比对发现犬弓首蛔虫的黏蛋白均具有SKhT保守结构域,且含有不同串联重复序列组成的黏蛋白结构域;种系发育分析结果显示与猪蛔虫进化关系较近;SDS-PAGE结果表明重组蛋白Tc-MUC-2相对分子质量为7.5×104,以可溶性形式表达;利用Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白,以250 mmol/L咪唑进行洗脱时可获得高纯度目的蛋白;将纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体,间接ELISA结果显示其多克隆抗体效价大于1∶512 000,表明重组蛋白的免疫原性较好,SDS-PAGE结果显示纯化后的抗体纯度高于95%, Western Blot结果显示抗体能与Tc-MUC-2蛋白特异性结合,表明... 相似文献
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[目的]为进一步研究口蹄疫病毒的诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上已公布的O型口蹄疫病毒核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至表达载体pGEX-6p-1中,经测序鉴定目的基因正确地整合至表达质粒中,用IPTG诱导重组基因表达。[结果]通过PCR扩增获得682 bp的目的片段,所克隆的VP1基因在原核细胞中成功表达,表达产物为融合蛋白,经SDS-PAGE鉴定分子量为51 kD,Western Blot结果表明融合蛋白具有免疫原性。[结论]获得了猪O型口蹄疫VP1融合蛋白,可作为包被抗原用于口蹄疫诊断试剂盒的研制。 相似文献
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人/猴免疫缺陷病毒SHIV衣壳蛋白p27的表达纯化及活性鉴定 总被引：1，自引：1，他引：0
利用PCR技术从质粒SHIV89.6P中扩增p27gag基因,并克隆入pMD18-T载体,测序鉴定;将p27gag基因插入表达载体pET32aT7启动子下游,构成重组质粒pET32a-p27并使其在大肠杆菌BL21中高效表达,最后利用固定化金属离子(Ni2+)配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白,Western Blot检测活性。结果显示,融合蛋白p27经SDS-PAGE电泳观察可见45ku的明显条带,与预期分子质量大小一致且多以可溶形式表达,目的蛋白占菌体总蛋白的36.8%;经镍柱纯化,获得目的蛋白p27纯度可达98%;经Western Blot试验检测,证明此融合蛋白p27能与SHIV阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原活性。该研究为进一步开发早期诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定了初步基础。 相似文献
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对雌激素受体α基因的氨基酸序列进行抗原性分析,筛选合适的基因片段进行克隆,经RT-PCR扩增得到大小为945bp的片段,经测序鉴定后,将该片段定向亚克隆于pMAL-c2x表达载体中,转化至TB1感受态细胞中进行诱导表达。经1mmol/L IPTG诱导4h观察到有新的重组蛋白获得了表达,采用SDS-PAGE和Western blot试验进行检测,结果表明表达的重组蛋白的分子质量约为78.1ku,表达产物占菌体总蛋白的42.3%,且具有免疫学活性。进一步纯化和蛋白酶切后,得到单一的雌激素受体α蛋白。以该蛋白免疫小鼠制备抗体,在免疫第7周时达到最大滴度1.158±0.232。将制备的多克隆抗体进行黄鳝性腺免疫组化分析,结果表明其能特异性地与卵巢中的激素受体α反应,在细胞膜上形成褐色沉淀。 相似文献
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《江苏农业科学》2017,(19)
试验构建猪肺炎支原体重组表达质粒pET30a-LppT,通过快速定点突变试剂盒将LppT基因中513、945、1 860、2 547 bp处的A突变为G,使改造后的LppT基因能在大肠杆菌系统中正确表达,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行了蛋白纯化,纯化的目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫新西兰大白兔制备LppT蛋白多克隆抗体。SDS-PAGE分析结果显示,IPTG诱导表达后获得1条特异性蛋白条带,分子质量约为110 ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以可溶形式表达于上清中,纯化的蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的LppT多克隆抗体进行Western Blot检测,结果表明制备的LppT多克隆抗体具有较强的特异性。 相似文献
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为获得鸡VEGF基因片段,原核表达GST-cVEG基因,并对融合蛋白进行分离纯化,应用RT-PCR从鸡睾丸中扩增出VEGF片段,将PCR产物克隆至pMD 18-T载体.随后,将cVEGF片段亚克隆至带有GST的原核表达载体pGEX-4T-2中,测序鉴定.将重组质粒pGEX4T2-cVEGF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,IPTG诱导,并进一步通过Ni-NTA Agarose亲合层析纯化,纯化产物以SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,结果表明,成功地构建了原核表达质粒pGEX4T2-cVEGF.GST-cVEGF融合蛋白在大肠杆菌中得到了表达,Ni-NTA Agarose纯化后得到较纯的蛋白.Western blot分析证实,纯化后蛋白是GST-cVEGF融合蛋白,为进一步研究CST-cVEGF融合蛋白疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础. 相似文献
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以CSFV FJ-1株为模板对猪瘟E2基因的主要抗原表位进行PCR扩增,得到大小为370bp的目的片段,将其连接到pET-32a表达载体,转化BL21后利用IPTG诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,目的蛋白成功获得表达,大小约33.5ku融合蛋白。利用Ni-NTA agarose纯化蛋白、重组蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后免疫新西兰兔,多克隆抗体效价经间接ELISA检测可高达1∶6400。Western blot结果表明该重组蛋白具有良好的反应原性,试验结果表明已成功获得猪瘟E2基因的多克隆抗体且能识别CSFV FJ-1毒株。 相似文献
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产肠毒素大肠杆菌F5菌毛基因的克隆与表达 总被引：1，自引：1，他引：0
应用PCR方法从产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)中扩增出不含信号肽序列的F5菌毛抗原基因片段,克隆测序后将其连接到大肠杆菌表达载体pET-30a(+)中,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,重组蛋白在BL21中得到表达并与F5菌毛单因子血清发生明显反应。 相似文献
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类枯草杆菌蛋白酶是昆虫致病真菌重要的毒力因子,利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因.将其与质粒pET28a连接,构建重组原核表达载体pET28-CDEP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测His-CDEP2融合蛋白以包涵体方式大量表达并对其进行纯化.用SDS-PAGE分离纯化的CDEP2蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗血清.Western blotting免疫印迹检测分析表明,该抗血清对CDEP2蛋白有特异性识别能力,可用于对CDEP2蛋白功能的进一步研究. 相似文献
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根据GenBank登录的MO HSP70基因序列,设计特异性引物对MO新疆分离株HSP70基因进行扩增,克隆入T载体中测序。将HSP70基因亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体pGEX4T-1-HSP70,并转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白分子质量为53ku;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组HSP70具有良好的反应原性。重组HSP70蛋白免疫小鼠后可诱导机体产生特异性抗体,证实该重组蛋白具有良好的免疫原性。 相似文献
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【目的】克隆鲤鱼春季病毒血症病毒（SVCV）的磷蛋白（P蛋白）基因,并对其进行原核表达,为进一步制备SVCV-P蛋白单克隆抗体及建立新的SVCV诊断方法奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增SVCV P蛋白基因,将其克隆入pET-28a(＋)载体中,获得原核重组表达质粒pET28-P,进行原核表达。将该重组原核表达质粒转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中,用0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达,用镍亲和层析试剂盒对表达产物进行纯化,分别用SDS-PAGE和Western Blotting方法对表达产物进行鉴定。【结果】成功克隆了SVCV-P蛋白基因,该基因长度为933 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET28-P,其诱导表达产物分子质量约为37 ku;表达的重组P蛋白可被SVCV阳性血清所识别。【结论】成功克隆了SVCV P蛋白基因,获得了分子质量约为37 ku的重组P蛋白。 相似文献
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【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性. 相似文献