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1.
Porcine circovirus type 2 (PCV2) is associated with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), which is an important economical disease affecting the pig industry worldwide. In order to develop an effective vaccine for PMWS, a recombinant pseudorabies virus (PRV) was generated and tested in piglets in this study. The PCV2 open reading frame 2 (ORF2) gene was inserted into pIECMV plasmid and co-transfected with PRV Tk-/gE-/LacZ+ genome into IBRS-2 cells to generate a recombinant Tk-/gE-/ORF2(+) virus. The expression of PCV2 ORF2 gene in the recombinant virus was confirmed by Western blotting and indirect immunofluorescence assay (IFA). Four-week-old piglets were immunized by the recombinant virus, and the immunogenicity of PRV Tk-/gE-/ORF2(+) was tested by PRV-enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), PRV neutralizing assay, ORF2-ELISA and ORF2 specific lymphocyte proliferation response. PRV Tk-/gE-/ORF2(+) elicited significant humoral immune responses to both PRV and PCV2, and the PCV2-specific lymphocyte proliferation response could be detected on day 49 of this experiment. These findings suggest that the recombinant PRV Tk-/gE-/ORF2(+) may be a potential vaccine against both PCV2 and PRV. 相似文献
2.
参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒（PRV）gH基N与猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRVgH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEMTEasy载体,转化大肠杆菌DH5a,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBRGreenI荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRv荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80．8℃和86．7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝／μL和180拷贝μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。 相似文献
3.
分别将猪圆环病毒2型的ORF2基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF5基因,插入到鸡痘病毒转移载体pUTA2-16-LacZ单一启动子和复合启动子下游,构建重组鸡痘病毒转移质粒pUTAL-ORF5-ORF2。将该重组质粒与鸡痘病毒282-E4株共转染鸡胚成纤维细胞,进行同源重组。通过3次溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)加压筛选,经RT-PCR、IFA和Western blot鉴定,表明重组鸡痘病毒中的目的基因在鸡胚成纤维细胞中得到表达,获得一株携带有目的基因ORF2和ORF5的重组鸡痘病毒rFPV-ORF2-ORF5。 相似文献
4.
猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。 相似文献
5.
猪圆环病毒与口蹄疫病毒二联重组鸡痘病毒的鉴定和BALB/c小鼠的免疫试验 总被引：1，自引：0，他引：1
以鸡痘病毒(FPV282E4)为活载体,用猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白、与复制相关蛋白基因及O型口蹄疫结构蛋白基因作为目的基因,经同源重组的方法获得2个重组鸡痘毒,分别命名为:vUTALP1-ORF2-ORF1、vUTALP1-ORF2。在复制、转录和翻译水平对这2个重组毒进行鉴定,结果表明这2个重组毒均能表达目的蛋白。将它们免疫6～8周龄BALB/c小鼠,每隔19d免疫1次,共3次;每10d尾跟采血1次,三免后10d杀鼠取脾。用ELISA方法检测小鼠血清抗体效价,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚类CD4+、CD8+数量。结果发现2个重组毒试验免疫组均是从最后一次采集的小鼠血清能获得最高的抗体效价,与对照组FPV相比都能产生一定的体液免疫反应,且以vUTALP1-ORF2-ORF1重组毒免疫小鼠产生的血清抗体效价最高;脾T淋巴细胞亚类数量测定发现,免疫试验组的CD4+与CD8+的T细胞亚类总数显著高于对照组(P0.05),并以vUTALP1-ORF2-ORF1数值较高。结果表明,这2个重组鸡痘毒既能较好的刺激细胞免疫又能产生一定的体液免疫,将作为候选活载体重组鸡痘毒进行本体动物免疫试验研究。 相似文献
6.
根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。 相似文献
7.
为探究猪痘病毒作为载体表达猪圆环病毒2型（PCV2）-Cap蛋白，插入外源基因P28-ORF2的拷贝数与PCV2-Cap蛋白表达量的关系。本试验以猪痘病毒为载体，通过双酶切连接及无缝克隆方法构建重组质粒，并纯化到了8株含不同拷贝数（1~8拷贝） P28-ORF2的重组猪痘病毒，基于荧光斑大小、电镜观察病毒粒子及Western blotting结果进行判断。纯化到的8株重组病毒的荧光斑直径为317.41~384.96 μm，大小无明显差异。重组猪痘病毒粒子形态与亲本病毒一致。Western blotting结果为插入1拷贝P28-ORF2的重组蛋白表达量最低；随着P28-ORF2拷贝数的增加，PCV2-Cap表达量也随之增加；至插入4拷贝P28-ORF2时，PCV2-Cap表达量达到峰值；随后减少。8株重组猪痘病毒荧光斑大小无明显差异，表明猪痘病毒基因组中插入不同拷贝数P28-ORF2对重组病毒在PK15细胞内的增殖无影响。重组猪痘病毒粒子的形态未发生变化说明多拷贝外源基因的插入并未对猪痘病毒的结构造成影响。本研究结果表明，猪痘病毒为载体表达外源蛋白时，单启动子启动多拷贝外源序列能明显提高外源蛋白的表达量，插入4拷贝的外源序列为较合适的拷贝数。 相似文献
8.
利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的ORF2基因与T细胞表位（T cell epitope,TCE）基因,表达的融合蛋白具有反应原性,为研制PCV2新型疫苗奠定基础。以pMD18-T-ORF2、pMD18-T-TCE为模板,采用PCR方法扩增目的基因ORF2和TCE,以多肽接头（Gly4Ser）3为连接子,运用重叠延伸PCR技术将2段基因通过连接子（Gly4Ser）3进行融合连接。将融合基因定向克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV构建重组质粒pShuttle-CMV-ORF2-TCE,将该重组质粒用PmeⅠ酶线性化后电转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞（内含pAdEasy-1骨架质粒）进行同源重组获得重组腺病毒质粒pAd-ORF2-TCE。PacⅠ酶线性化pAd-ORF2-TCE质粒后转染AD293细胞包装病毒,重组腺病毒经3轮噬斑纯化后获得重组腺病毒rAd-ORF2-TCE,病毒滴度为1012.3 TCID50/mL。Western blotting及间接免疫荧光试验（indirect immunofluorecent assay,IFA）结果表明融合蛋白得到正确表达。 相似文献
9.
为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5.经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白.免疫SPF小鼠,检测鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平.结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫. 相似文献
10.
设计1对针对猪圆环病毒2型（PCV2）全基因组的特异性引物,从疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后构建重组质粒pMD18-T Simple-PCV2（命名为P-S-PCV2）。用ORF9特异的限制性内切酶Bpu10Ⅰ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF9基因缺失突变的重组质粒（命名为P-S-PCV2-J）。用SacⅡ对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应缺失基因DNA（命名为PCV2-J）。用PCV2-J缺失突变株进行细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究。结果显示：PCV2-J转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长;PCV2-J接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV2-J突变病毒的感染;PCV2-J免疫仔猪后的抗体水平在第2周开始上升,与对照组相比差异显著,CD3＋下降,与对照组无差异,CD4＋下降,第1周与对照组差异显著,CD8＋与对照组差异不显著。结果表明,ORF9基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,但免疫原性减弱。 相似文献
11.
Porcine circovirus type 2 (PCV2), a single-stranded DNA virus, is associated with postweaning multisystemic wasting syndrome
(PMWS). ORF2 protein (capsid) of PCV2 was recently demonstrated to be a major immunogenable to induce protection in pigs with
a prime–boost protocol. In this study, the ORF2 gene of PCV2 was expressed in insect cells. The product self-assembled into
particles that were structurally and antigenically indistinguishable from regular PCV2 capsids. To evaluated the immunogenicity
of these virus-like particles, PCV2-free piglets were vaccinated with the crude lysate from recombinant baculovirus (Ac.ORF2)-infected
insect cells, at doses of 0.1 ml (106 cells), 0.5 ml (5 × 106 cells) or 1.0 ml (107 cells). The immune response was monitored by an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for PCV2 antibody and
lymphocyte proliferation assay. The ELISA results indicated that primary immune response was elicited with 0.5 ml or 1.0 ml
of crude lysate from Ac.ORF2. After boost immunization, relatively higher levels of PCV2 antibody were elicited in 0.5-ml
or 1.0-ml vaccinated groups, compared to the 0.1-ml group. In addition, higher PCV2 specific lymphocyte proliferation response
was developed in piglets vaccinated with 0.5 ml or 1.0 ml of crude lysate, especially in those vaccinated with with 1.0 ml
of crude lysate. Thus, the expressed ORF2 protein has significant potential as a subunit vaccine against PCV2 infection. 相似文献
12.
根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。 相似文献
13.
Chen HC Yang SH Kuo TY Lai SS 《The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science》2011,73(8):1097-1100
This study described construction and transfection of an EGFP-fused Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) genome and the recovery of the virus. Posttransfection, PCV2 (ORF1)-EGFP/pSK, PCV2 (ORF3)-EGFP/pSK, PCV2 (ORF4)-EGFP/pSK and PCV2(ORF5)-EGFP/pSK showed no fluorescent signals in transfected cells, while green fluorescent signals were observed in the nuclei of PK-15 cells after PCV2 (ORF2)-EGFP/pSK transfection. The presence of ORF2-EGFP fusion protein was demonstrated by dual signals of green fluorescence and anti-PCV2 antibodies conjugated with rhodamine in an immunofluorescence assay (IFA). Furthermore, the released EGFP-fused PCV2 genome was demonstrated by real-time PCR. 相似文献
14.
为了给猪圆环病毒病的诊断及防制提供科学依据,试验参考GenBank中猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2) ORF1基因序列,设计1对特异性引物,进行ORF1基因的PCR扩增,扩增出PCV2贵州株ORF1基因片段。扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET-30a(+)原核表达载体中,经双酶切鉴定后测序。结果表明,ORF1基因在pET-30a(+)载体中位置正确,pET30a-PCV2-ORF1原核表达质粒构建成功,转化至Rosetta菌,用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE检测,结果显示PCV2-ORF1在pET-30a(+)中获得了高效融合表达,其表达蛋白分子质量约为42 ku。重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni2+离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,Western blotting分析结果表明,表达蛋白能和抗His标签的单克隆抗体反应。 相似文献
15.
参照GenBank发表的猪伪狂犬病毒囊膜糖蛋白gB主要抗原表位的编码区基因序列,设计一对引物,通过PCR扩增后,将约为600bp的目的片段克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32(a)的T7启动子下游,构建的重组质粒pET-gB经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量约为42.4KDa,主要以包涵体形式存在。BandScan分析表明,表达量约占菌体蛋白的60.5%。利用His亲和层析方法得到了纯化的表达产物。Western blotting结果显示,重组蛋白能与阳性血清发生特异性反应,具有较好的抗原反应原性,可以作为检测用抗原。 相似文献
16.
参照GenBank上收录的基因组序列自行设计引物,分别扩增猪圆环病毒2型ORF2和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5。将外源基因分别插入经改造的杆状病毒穿梭载体pFVC,获得3种重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2。将重组质粒pFVC-ORF2、pFVC-ORF5、pFVC-ORF5-ORF2分别转入带有杆状病毒骨架的DH10BacTME.coli感受态细胞中。提取高质量的重组质粒rBacmid-ORF2、rBacmid-ORF5、rBacmid-ORF5-ORF2,将重组质粒转染Sf9细胞,获取重组病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2。通过间接免疫荧光检测证实了外源基因正确表达。重组杆状病毒rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2对BALB/c小鼠的免疫试验结果显示,rAc-ORF2、rAc-ORF5、rAc-ORF5-ORF2均能够刺激小鼠机体产生免疫应答,产生抗体,并能持续较长时间。 相似文献
17.
根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪病料中扩增出了ORF3基因,将其克隆到高效真核表达载体pEGFP- N2中,筛选出含有ORF3基因的重组质粒,命名为pEGFP-N2-ORF3.对此重组质粒进行测序分析,结果表明,克隆的ORF3基因与其他PCV2的ORF3核苷酸序列相似性为96.2％-99.0％,氨基酸序列同源性为90.5 ％～98.1％.将重组质粒纯化后转染COS-7细胞,用PCR方法扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光,结果转染pEGFP- N2-ORF3重组蛋白在细胞核和细胞浆中均有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性.本研究为进一步探讨ORF3的结构和功能提供理论依据. 相似文献
18.
根据GenBank登录的猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gE基因、PRRSV的N基因的目的片段,通过优化反应中各个影响因素,建立了PRV、PCV2、PRRSV的多重PCR（mPCR）检测方法。敏感性和特异性的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为32.5（PRV）、25.2（PCV2）、35.9pg（PRRSV）。该方法对猪流感病毒（SIV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、大肠杆菌、猪瘟病毒（CSFV）、猪流行性腹泻病毒（TGE）等病毒的检测结果均为阴性。200份临床样品的多重PCR结果表明,PCV2感染率为80%（160/200）,PRV感染率为21%（42/200）,PRRSV的感染率为78%（156/200）。200份临床样品主要为PCV2和PRRSV混合感染,阳性率达56.0%（112/200）。该方法的建立对这3种病毒病的早期快速检测和指导临床实践具有十分重要的意义。 相似文献
19.
共表达猪细小病毒VP2蛋白和猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组伪狂犬病毒的构建及其鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为研制猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)3联苗,本研究将PPV VP2基因和PCV2 Cap基因通过口蹄疫病毒2A基因串联得到VP2-2A-Cap(V2C)基因,将其插入pEP-CMV-in转移载体构建pEP-V2C-in重组表达质粒,再通过Red/ET两步重组法在大肠杆菌中构建了pPRV-V2C-ΔgE和pPRV-ΔgE突变体,该突变体用磷酸钙法转染BHK-21细胞获得重组病毒rPRV-V2C-ΔgE和rPRV-ΔgE。Western blot分析表明rPRV-V2C-ΔgE能够在BHK-21细胞内表达融合蛋白VP2-2A-Cap,而且目的蛋白能够被2A蛋白裂解为64 ku和28 ku两个片段。重组病毒生长曲线和噬斑大小测定结果显示rPRV-V2C-ΔgE在BHK-21细胞中的增殖滴度与亲本株rPRV无显著差异,表明外源基因的插入不影响rPRV的增殖。本研究为PRV、PPV和PCV2 3联重组活载体疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
20.
表达H3N2亚型猪流感病毒HA基因重组伪狂犬病病毒的构建 总被引：4，自引：1，他引：4
将SV40启动子控制下的LacZ基因表达盒和CMV启动子控制下的H3N2亚型猪流感病毒（SIV H3N2）的HA基因插入到伪狂犬病病毒（PRV）通用转移载体pBdTK-Uni中，获得转移载体pLTK-HA。将该载体与PRV Bartha-K61株基因组DNA通过脂质体法共转染Vero细胞，经过10代蓝斑筛选、纯化和PCR鉴定获得了一株插入SIV HA基因的重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-HA。Western blotting和间接免疫荧光试验证实HA基因在重组病毒感染的细胞中获得了表达。用不同的细胞（PK-15、IBRS-2、Vero和鸡胚成纤维细胞）对该重组病毒与亲本病毒的增殖滴度和致细胞病变进行比较，未见显著差异，对第30代重组病毒的HA基因进行序列分析，表明该重组病毒遗传性状稳定。 相似文献