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1.
多重RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒 总被引：5，自引：0，他引：5
为了检测、区分猪传染性胃肠炎(TGE)和猪流行性腹泻(PED)，建立了同时检测这2种疾病痛原体的多重PCR方法。参考GenBank登录的TGEV和PEDV纤突蛋白S基因序列，经DNAsis 2．0比较分析。分别筛选出TGEV、PEDVS基因相对保守区。以TGEV TH-98株(GenBank登陆号为AF494337)和PEDV CV777株(GenBank登陆号为NC003436)为参考模板，利用软件Primer3设计合成了2对寡核苷酸引物，以ST细胞培养的TGEV和PEDV毒株核酸为模板。利用所设计的2对引物进行多重RT-PCR扩增，结果同时得到与试验设计相符的499bp(TGEV)和199bp(PEDV)的扩增条带。而对其他3种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明。建立的多重RT-PCR方法可检测出10pgTGEV RNA和100pg PEDV RNA。 相似文献
2.
为建立同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)的多重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV S基因、TGEV S基因和PRV VP6基因序列设计合成引物,利用这3对引物对同一样品中的PEDV、TGEV、PRV进行多重RT-PCR扩增,结果显示,该方法可以同时扩增PEDV(682 bp)、TGEV(480 bp)和PRV(297 bp)的特异性DNA片段,而对猪瘟病毒和猪伪狂犬病毒的PCR扩增结果均为阴性;敏感性试验结果表明,该多重RT-PCR方法对PEDV、TGEV和PRV的最低检出量分别为3.3×103拷贝/μL、3.2×103拷贝/μL和2.8×103拷贝/μL。利用建立的多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR对20份临床病料进行检测,结果显示,两者的总符合率为100%。结果表明建立的多重RT-PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可以用于这3种病毒的同时检测和疾病的鉴别诊断。 相似文献
3.
猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒多重PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因序列、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因和猪博卡病毒(PBoV)NP1基因序列,设计合成3对引物。通过优化反应条件,对TGEV、PEDV RNA反转录获得的cDNA模板和PBoV的DNA模板进行多重PCR扩增,同时得到3条与试验设计相符的1 060bp(TGEV)、462bp(PEDV)及258bp(PBoV)特异性条带,建立了同时检测TGEV、PEDV和PBoV的多重PCR方法。结果表明,在同一PCR反应体系中,可以同时检测这3种病毒核酸片段,而对其他病毒的检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法的最低检测限分别为35、20、10pg的核酸。采用该方法对60份临床样品进行检测,TEGV阳性率为1.6%,PEDV阳性率为6.7%,PBoV阳性率为21.7%,表明建立的方法可以应用于临床检测。 相似文献
4.
《养禽与禽病防治》2016,(4)
根椐GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒[AIV(H9)]和传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的NDV、AIV(H9)和IBDV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增NDV的466bp、AIV(H9)的685bp和IBDV的244bp的特异性片段,而对其他4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10pg的NDV、10pg的AIV(H9)和1pg的IBDV模板。用53份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速及准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
5.
《畜牧与兽医》2020,(9)
旨在建立快速准确检测与猪腹泻相关的猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRoV)多重PCR检测方法。针对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的基因组序列设计了4对特异性引物,分别扩增PDCoV N基因(447 bp)、PEDV M基因(204 bp)、TGEV M基因(612 bp)、PRoV VP6基因(329 bp),经过对反应条件的优化,成功建立了能同时特异性检测PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的多重RT-PCR,且特异性好。应用该检测方法对上海及周边地区养殖场临床猪腹泻病料进行检测,结果检出PEDV阳性样品16份,其中PEDV和TGEV混合感染1份,PDCoV和PRoV均未检出,与单一RT-PCR检测结果完全吻合。该快速检测方法的成功建立,将有助于提高对PDCoV、PEDV、TGEV、PRoV的病原学调查和疾病监测,为生态养殖提供技术储备。 相似文献
6.
猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用 总被引：14，自引：1，他引：13
本试验旨在建立能同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的多重RT-PCR检测方法。根据GenBank收录的PEDVM基因、TGEVN基因、GARVP7基因,利用软件Pri mer 5.0设计合成能分别特异性扩增PEDV、TGEV、GAR相应基因的引物。利用这3对引物,作者建立了一种新的能够同时检测PEDV、TGEV和GAR的多重RT-PCR方法,并将这种方法和常规的RT-PCR进行了比较。实验室检测中,多重RT-PCR检测方法能够检测到35 pg的TGEV-PEDV-GAR三联苗的混合RNA。应用该方法检测了华中地区75份腹泻猪粪样,同时利用常规RT-PCR检测方法对该检测方法的敏感性和特异性进行了分析,结果表明该方法检测PEDV、TGEV、GAR的敏感性分别为92%、100%、100%,特异性均为100%。该方法敏感性高、特异性强,是一种新的检测PEDV、TGEV和GAR的方法。 相似文献
7.
本试验的目的在于建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪轮状病毒(RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的多重PCR检测方法。试验设计并合成了4对特异性引物,对样品中的PRV,RV,TGEV和PEDV进行了多重PCR扩增。结果显示,该方法可同时扩增出PRV(497 bp),RV(1 356 bp),TGEV(238 bp)和PEDV (610 bp)的特异性目的片段,而对PPV,PCV,PRRSV和HCV的PCR扩增结果均为阴性。利用建立的多重PCR检测方法和单项PCR对60份临床病料进行检测。结果显示,两者的总符合率为95.0%。表明建立的多重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于上述4种病毒的早期鉴别诊断及大规模的流行病学调查。 相似文献
8.
《中国兽医学报》2016,(2)
为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(RVA)的敏感、特异的多重RT-PCR(mRT-PCR)方法,本试验分别针对PEDV和TGEV的N基因、RVA的VP7基因设计了4对引物(其中针对PEDV N基因的引物为内、外2对),结合mRT-PCR和PEDV的套式RT-PCR(nRTPCR),建立了检测PEDV、TGEV和RVA的mRT-PCR方法。mRT-PCR能够同时扩增出针对3种病毒的预期大小的目的核苷酸片段,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病毒及猪圆环病毒2型等病毒无交叉反应;可以检测到PEDV、TGEV和RVA的最低核酸浓度分别为16.07、803.9和321.5μg/L。应用mRT-PCR检测了31份腹泻仔猪的血清、肛拭子或小肠组织,其中PEDV、TGEV与RVA的阳性率分别为61.29%、6.45%和25.81%,并检测到了PEDV与RVA或TGEV双重感染及PEDV、TGEV和RVA三重感染的样品。在检测临床样品时,mRT-PCR和单项RT-PCR检出PEDV、TGEV和RVA的符合率分别为96.77%、93.54%和93.54%。上述结果表明,mRTPCR能够快速鉴别检测PEDV、TGEV和RVA 3种病毒,PEDV是引起当前仔猪腹泻的主要病原。 相似文献
9.
本研究旨在建立一种用于临床腹泻病例中猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）快速检测的一步法双重RT-PCR方法。根据GenBank中收录的PEDV和TGEV的基因序列,分别设计两对特性引物,经最佳反应条件的优化和选择,结果显示,该一步法双重RT-PCR检测方法能同时特异性扩增PEDV和TGEV,该方法可检测到稀释度1×10-5的疫苗毒。应用本方法检测2015年度实验室收集的疑似样品,PEDV阳性率为100%。本研究建立的方法快速、敏感性高、特异性强,可用于临床PEDV和TGEV的快速检测及流行病学调查。 相似文献
10.
猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重RT-PCR检测方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均是能引起仔猪腹泻的冠状病毒,通过临床症状和剖检很难鉴别诊断,建立同时检测且能够鉴别诊断这3种疾病的快速检测方法对于临床诊断具有重要的意义。参照GenBank中登录的PDCoV,NPEDV M和TGEV N基因的基因序列,利用Primer5.0设计合成3对能扩增特异性目的片段的引物,构建重组质粒,并对RT-PCR反应条件进行优化,建立了检测PDCoV,PEDV和TGEV的多重RT-PCR诊断方法,并对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性分析。利用该方法对河南176份临床样品进行检测,并与普通RT-PCR检测方法对该检测方法进行比较分析。结果表明,所建立的三重RT-PCR方法对PDCoV的最低检测量是3.14×103拷贝/μL;PEDV的最低检测量是3.88×104拷贝/μL和TGEV的最低检测量是3.68×104拷贝/μL。所建立的方法具有较好的特异性,对猪博卡病毒(PboV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟(CSFV)和猪圆环病毒(PCV)等猪常见病毒的扩增结果均为阴性。应用所建立的三重RT-PCR方法对176份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV,PDCoV和TGEV检测,并将检测结果和单重RT-PCR检测方法比较,结果显示,多重RT-PCR检测结果与常规单一RT-PCR的结果符合率均为100%。综上,本试验建立了能同时检测PDCoV,PEDV和TGEV的三重RT-PCR方法,为临床上这3种疫病的快速检测和流行病学调查奠定了基础。 相似文献
11.
应用多重RT-PCR方法检测158例猪粪样中的两种冠状病毒 总被引：7，自引：0，他引：7
根据GenBank上发表的猪流行性腹泻（PEDV）和猪传染性胃肠炎（TGEV）基因序列，针对其PEDVM（膜蛋白）基因保守区及TGEV的S基因（纤突蛋白基因）5’端保守区，各设计一对引物，可特异扩增出目的条带大小分别为467bp和1062bp。用上述两对引物对同一样品中的PEDV和TGEV可进行鉴别检测，对猪的其它病毒和细菌的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明：该双重PCR方法能检出PEDV1pg、TGEV0．1pg的模板。同时采用建立的多重RT-PCR及韩国引进的PEDV和TGEV病毒抗原快速诊断试剂盒检测结果显示：此多重RT-PCR方法特异性强，且较快速试剂盒更加敏感。应用多重RT-PCR对158份临床猪粪样的检测结果表明：我国很多猪场普遍存在TGEV和PEDV，尤其以PEDV污染更为严重，感染率达53．2％，但双重感染率较低，仅为4，4％。 相似文献
12.
为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。 相似文献
13.
猪传染性胃肠炎病毒NASBA检测方法的建立 总被引：2，自引：0，他引：2
为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)NASBA的检测方法,本研究利用BioEdit和BlastN,根据GenBank中猪TGEV的S基因保守序列设计引物,建立了扩增TGEV的NASBA检测技术。利用该方法建立的反应体系在41℃反应2h即可得到有效扩增。实验结果表明:该方法对TGEV进行扩增获得约200bp特异性目的条带,而对CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV、PEDV和ST细胞扩增结果均为阴性。NASBA的灵敏度高于普通RT-PCR,与病毒分离方法相当,可检测到5pg的核酸。该方法为TGEV的早期诊断提供了新途径。 相似文献
14.
根椐GenBank中牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)和牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV-3)3种病毒基因序列,设计合成引物,建立3种病毒的三重RT-PCR方法。用这3对引物对同一样品中的BVDV、BRSV和BPIV-3核酸模板进行三重RT-PCR扩增,结果显示:可同时扩增BVDV的466 bp,BRSV的735 bp和BPIV-3的258 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10 pg的BVDV、1 pg的BPIV-3和10 pg的BRSV模板。用37份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示:两者的总符合率为100%。结果表明:建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
15.
多重RT-PCR检测猪口蹄疫病毒、猪水泡病病毒和猪水疱性口炎病毒的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
建立了一种同时检测猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪水泡病病毒(SVDV)和猪水疱性口炎病毒(VSV)三种病原体的多重RT-PCR方法。参照文献报道的基因序列,设计合成了三对特异性引物;PCR扩增条件进行优化后,用这三对引物对同一样品中的FMDV、SVDV、VSVRNA模板进行扩增,结果同时得到了三条特异性条带,大小与试验设计相符:FMDV(208bp)、SVDV(862bp)、VSV(638bp),且对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核酸扩增结果为阴性;三种病毒RNA模板检出的最小量均为10fg。试验证明,此方法经济、快速、敏感、特异,可用于FMDV、SVDV和VSV这三种猪水泡性疾病的鉴别诊断及流行病学调查。 相似文献
16.
《养禽与禽病防治》2015,(11)
根椐GenBank中已发表的基因C型鸭肝炎病毒(DHV-C)和基因A型鸭肝炎病毒(DHV-A)2种病毒基因序列,分别设计2对特异性引物。在建立2种病毒单项一步法RT-PCR检测方法的基础上,优化一步法双重RT-PCR反应条件,建立了2种病毒的一步法双重RT-PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的DHV-C、DHV-A核酸模板进行一步法双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增DHV-C的270bp和DHV-A的479bp的特异性片段,而对其他4种鸭源病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检出10 pg的DHV-C和10 pg的DHV-A模板。通过对68份临床病料检测,将建立的一步法双重RT-PCR技术和单项一步法RT-PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对DHV-C和DHV-A的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
17.
为了建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的快速鉴别诊断方法,试验根据GenBank中已发表的PEDV和TGEV的相关基因序列,设计合成特异性引物,分别进行单项PCR最佳反应条件的摸索;确定最佳反应条件后建立PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,并进行特异性分析;同时采用单项RT-PCR和二重RT-PCR法检测临床样本,比较两种方法的检出率。结果表明:试验成功建立了PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法,经最佳退火温度摸索,二重RT-PCR法的最佳退火温度为58.1℃;经特异性分析,二重RT-PCR法对PEDV和TGEV具有很好的特异性;临床样本的检测结果显示,二重RT-PCR法与单项RT-PCR法检出率基本吻合。说明试验建立的PEDV和TGEV的二重RT-PCR检测方法可用于猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻病的快速鉴别诊断。 相似文献
18.
猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为了研究出一种快速、敏感、特异的诊断猪传染性胃肠炎和猪流行腹泻的方法,试验参照国内外已发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据猪传染性胃肠炎病毒S蛋白基因和猪流行性腹泻病毒s蛋白基因各设计1套特异性通用引物,扩增目的带分别为426 bp和584 bp.结果表明:建立的猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒二联RT-PCR检测方法具有快速、敏感、特异等优点,可为猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础. 相似文献
19.
为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明：优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率... 相似文献
20.
根椐GenBank中已发表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)2种病毒基因序列,分别设计2对引物。在建立2种病毒单项一步法RT-PCR检测方法的基础上,优化一步法二重RT-PCR反应条件,建立了2种病毒的一步法二重RT-PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV核酸模板进行一步法二重RT-PCR扩增,结果可同时扩增美洲型PRRSV的265 bp和欧洲型PRRSV的451 bp的特异性片段,而对其他4种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检出10 Pg的美洲型PRRSV和10 pg的欧洲型PRRSV模板。通过对175份临床病料检测,将建立的一步法二重RT-PCR技术和单项一步法RT-PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法二重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对美洲型和欧洲型PRRSV的同时检测和鉴别诊断。 相似文献