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1.
为研制传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得3株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验(IFA)证明,3株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明3株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了试验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102 TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR 3种方法同步检测8种试验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异(P>0.05)。 相似文献
2.
用E.coliO157∶H7菌体免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了16株分泌单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。其中,1D3、2E7和2H7三株为O157∶H7特异单克隆抗体,Ig亚类分别为IgMκ、IgG2bκ和IgG2bκ,腹水抗体ELISA效价分别为103、105和106。用纯化的单克隆抗体2E7标记胶体金,制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜（NC）上;组装成双抗夹心法O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测O157∶H7,敏感度为106CFU/mL,与相同单克隆抗体2H7和2E7建立的O157∶H7夹心ELISA检测方法的敏感度相当,试纸条简便快速,在1~5 min内可得出检测结果,便于O157∶H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。 相似文献
3.
为制备角蛋白19片段（CYFRA21-1）的单克隆抗体（mAb）,采用间接 ELISA 方法检测免疫小鼠的抗体效价,融合、筛选、克隆化单克隆抗体,将筛选得到的单克隆细胞株注入小鼠腹腔制备腹水,采用辛酸硫酸铵法、蛋白 A 柱纯化腹水抗体,以 SDS-PAGE 凝胶电泳、紫外分光光度法检测抗体纯度和浓度;利用鼠抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体进行亚型鉴定;采用阻断 ELISA 法测定 mAb 的敏感性（IC50）。结果表明,筛选获得4株分泌角蛋白19片段 mAb 的细胞株,将4株细胞株2F9、3H5、7C3、6F11注入小鼠腹腔,分别获得效价为2．56×105、5．12×105、5．12×105、2．56×105的单克隆抗体,经纯化,抗体蛋白浓度为12．43 mg／mL～16．00 mg／mL,为 IgG1型抗体,其 IC50在1．03 ng／mL～1．53 ng／mL 之间。说明获得了4株分泌高效价 CYFRA21-1单克隆抗体的细胞株,为建立 CYFRA21-1的检测试剂盒奠定了基础。 相似文献
4.
为建立可检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的间接ELISA检测方法,本研究经RT-PCR扩增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段,并应用pET28a载体进行原核表达,亲和层析纯化重组蛋白作为包被抗原,建立检测IBDV血清抗体的间接ELISA方法。应用所建方法和IDEXX试剂盒,对采自不同地区的156份鸡血清样品进行平行检测和比较。结果表明,RT-PCR扩增获得708bp的VP2基因片段;含重组表达质粒pET28a-VP2的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,表达了约27kDa的VP2重组蛋白,表达量约占菌体蛋白的30.1%;建立的间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒比较,其特异性、敏感性和符合率分别达到90.24%、95.65%和94.23%。由此可见,本研究所建立的间接ELISA方法敏感、特异,适用于IBDV血清抗体的检测。 相似文献
5.
传染性法氏囊病病毒检测系统的建立 总被引：4，自引：0，他引：4
为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)检测系统,本试验在同一个试验技术平台上对9种IBDV检测方法进行了比较分析.IBDV野毒株盲传4～5代可适应于鸡胚和鸡胚成纤维细胞,死亡胚体水肿、出血,病变细胞圆缩、脱落.4个血清Ⅰ型1BDV毒株,用交叉中和试验可进一步分为3个血清亚型.用RT-PCR/SSCP技术分析4个毒株,扩增产物的电泳迁移率有差异.AGP、间接ELISA、夹心抑制ELISA以及中和试验等4种方法同时检测不同来源血清样品中的IBDV抗体,其他3种方法比AGP具有更高的敏感性,敏感度相差104倍.用AGP检测法氏囊组织样品,抗原效价可达到1:10,而细胞培养物和病鸡粪便则没有出现沉淀线;3种样品用夹心ELISA、RT-PCR、cDNA探针斑点杂交、RT-PCR/SSCP检测以及病毒分离等5种方法检测,均为阳性. 相似文献
6.
为建立敏感、特异、稳定的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法,本试验以杆状病毒表达系统表达的重组IBDV-VP2结构蛋白为抗原,通过包被VP2单克隆抗体捕捉VP2结构蛋白的形式,建立鸡血清VP2结构蛋白抗体ELISA检测方法(VP2-ELISA)。条件优化结果显示:单克隆抗体最适包被质量浓度为3mg/L,VP2最佳稀释度为1∶20,夹心ELISA效价1∶12.8,被捡血清的稀释度为1∶400。该方法与禽流感、鸡新城疫、鸡马立克氏病、鸡传染性喉气管炎病毒及杆状病毒阳性血清无交叉反应,对琼扩效价为1∶32的IBDV阳性血清的最低检出量为1∶12 800,ROC曲线确定的D450nm临界值为0.236,组内、组间重复性试验变异系数均小于10%。用本试验建立的VP2-ELISA方法与进口IBDV-ELISA抗体试剂盒平行检测100份背景已知的临床鸡血清样品,总符合率VP2-ELISA(97%)高于进口ELISA试剂盒(96%)。本试验为进一步研制鸡传染性法氏囊病病毒VP2结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒奠定基础。 相似文献
7.
试验旨在研究一株传染性法氏囊病病毒（IBDV）河南分离株的毒力特征及其与VP2氨基酸序列特征的关系。通过提取IBDV C4株RNA,利用RT-PCR扩增其VP2基因,与其他不同毒力IBDV毒株进行核苷酸及推导的氨基酸序列比对分析,同时使用pET-32a（+）原核表达载体表达VP2基因,用SDS-PAGE和Western blotting检测重组VP2蛋白的表达。结果显示,扩增的IBDV C4株的VP2基因序列在进化关系上属于超强毒力IBDV（vvIBDV）分类,与选取的vvIBDV毒株代表毒株核苷酸序列同源性在98.1%~98.7%之间,其七肽区为S-W-S-A-S-G-S（第326-332位氨基酸）符合超强毒株特征,且222（A）、256（I）、294（I）和299（S）位氨基酸与超强毒力毒株的4个特征性氨基酸一致;但IBDV C4毒株的VP2蛋白氨基酸序列与超强毒力毒株代表毒株UK661相比,201（D/G）、281（G/R）、313（V/A）位氨基酸不同,其中281位氨基酸的改变处于279-290的小亲水区内,与病毒抗原性有关;构建的pET-32a（+）-VP2原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞上表达出分子质量约67 ku的重组VP2蛋白,为进一步比较201（G）、281（R）、313（A）位氨基酸差异导致的抗原特性改变提供了研究基础。本试验结果表明,IBDV C4株VP2基因与vvIBDV毒株VP2基因的主要特性一致,但也有3处氨基酸与代表毒株UK661存在差异,这些改变可能与中国IBDV毒株毒力的进化有关。 相似文献
8.
IBDV血清Ⅱ型VP5蛋白原核表达及型特异性单克隆抗体的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
本实验构建表达了传染性法氏囊病病毒(IBDV)血清Ⅱ型23/82株VP5蛋白,并制备出能够区分不同血清型IBDV的单克隆抗体(mAb).利用EcoR I和Xho I双酶切pUC57-23/82VP5质粒,获得23/82株IBDV VP5基因片段,连接到同样处理的原核表达质粒pET-28a,经酶切鉴定获得重组质粒pET-23/82VP5,转化到宿主茵BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白,SDS-PAGE分析表明该融合蛋白分子量大小约为23 ku.Ni-NTA柱纯化重组蛋白,复性后免疫8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后,常规方法进行细胞融合,获得1株阳性杂交瘤细胞株(5D3),IFA和western blot分析表明该细胞株分泌的mAb仅与血清II型IBDV 23/82株VP5反应,不与血清I型IBDV Gt株VP5反应.腹水抗体间接ELISA效价为1×104.该mAb的制备为研究血清II型IBDV的VP5的功能和标记疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
9.
传染性法氏囊病病毒抗原表位分析--单克隆抗体的制备与鉴定 总被引：3，自引：1，他引：3
将传染性法氏囊病病毒(IBDV)分离毒株ZB和TA3的细胞培养物采用不连续蔗糖密度梯度离心的方法浓缩纯化病毒,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了6株分泌抗IBDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系1C1、1E6、2B2、2G8、3A2、3E2。间接ELISA测定,杂交瘤细胞培养上清液的抗体效价为102,诱生腹水的抗体效价为106～107。相加ELISA分析,这6株单克隆抗体对应不同的病毒抗原表位。中和试验结果表明,2G8对病毒有较强的中和能力,腹水的中和效价为105。用2B1和3E2配对建立的夹心ELISA可特异地检测IB DV。 相似文献
10.
应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1461bp的VP2基因，将其克隆于pET-28a载体，筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导，在其宿主菌BL21（DE3）中成功表达了53．7ku的蛋白，SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示，VP2表达产物以包涵体形式存在，可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性，用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测，结果，复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍；用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA，结果显示，VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3c7反应强（＋＋＋）；与4E4、1H11反应中度（＋＋）；与4E5、3C4、1E11、3H9反应较弱；而与EC6、3D12、1A1无反应。 相似文献
11.
对虾白斑综合症病毒双抗体夹心ELISA方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
用将纯化的对虾白斑综合症病毒VP28蛋白免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了2株（2G9,3E5）可以稳定分泌抗对虾白斑综合症病毒特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的VP28蛋白免疫家兔,按常规方法制备多抗。选用单抗（3E5）包被ELISA板,用兔多抗作为捕获抗体,建立了对虾白斑综合症病毒的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,为对虾白斑综合症病毒的检测提供了有效工具。 相似文献
12.
牛γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
以纯化的rHis-BoIFN-γ制备兔多抗血清,辛酸—硫酸铵两步法对体内诱生的抗rBoIFN-γ单抗腹水进行纯化,用美洲商陆素（Pokeweed mitogen,PWM）刺激奶牛全血产生的分泌性天然BoIFN-γ筛选出与之反应最佳的单抗5E11。将单抗5E11以40μg/mL浓度包被,与1∶3 000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清（13.8μg/mL）配对,以1∶6 000稀释的商品化酶标羊抗兔IgG为指示抗体,建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法,该方法可以检出2.56 U/100μL（30.5 pg/100μL）的rHis-BoIFN-γ、8U/100μL的rBac-BoIFN-γ和1U/100μL的分泌性天然BoIFN-γ。以商品化试剂盒作为平行对照,将获得的奶牛临床检测血浆样品使用BoIFN-γ抗原捕获ELISA法进行检测,结果显示两种方法检测符合率达到83.9%。本研究建立的BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法可有效检测分泌性IFN-γ,为进一步开发BoIFN-γELISA检测试剂盒奠定了基础。 相似文献
13.
应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白（Mature chicken interleukin-18,mChIL-18）的2株单克隆抗体（mAb）1G9和2E6,建立检测mChlL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg／L,检测抗体的工作效价为1：800,待检样品的最佳稀释度为1：400,检测敏感度可达31．5ng／L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著（P〈0．05）。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。 相似文献
14.
用副猪嗜血杆菌（HPS）血清5型灭活菌液免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,以HPS外膜蛋白5（OMP5）为抗原,经间接ELISA法筛选阳性融合孔,并用有限稀释法对筛选的阳性孔进行亚克隆,获得2株分泌抗HPS OMP5单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E2和8D9;间接ELISA法效价检测,1E2和8D9细胞培养上清抗体效价均为1∶2 560,纯化后腹水抗体效价分别为1∶204 800和1∶51 200;抗体型别鉴定,1E2和8D9分别分泌IgG2b、IgG2a型抗体;特异性检测表明,2株单抗均能特异识别OMP5。将2株杂交瘤细胞反复冻融3次复苏后仍能稳定分泌抗体。2株抗HPS OMP5单克隆抗体的成功制备,将为HPS感染快速检测方法的建立以及检测试剂的研制奠定基础。 相似文献
15.
为获得针对猪源EMCV结构蛋白VP2的特异性单克隆抗体,本试验以EMCV结构蛋白VP2为对象,将EMCVBJC3株VP2基因定向插入穿梭质粒中,构建重组腺病毒AdV—VP2,免疫BALB／c小鼠制备单克隆抗体,利用Pepscan技术对单抗识别的抗原位点进行分析。结果显示,间接ELISA及间接免疫荧光法筛选获得了2个阳性细胞克隆株,命名为C11和G8。经检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1：1600,腹水效价分别为1：2．56×106和1：1.28×106,中和试验鉴定均无中和活性。Western—blot鉴定表明获得的2株单抗均能识别原核表达的重组VP2蛋白。亚类鉴定结果显示2株单抗均为IgG2b亚类,轻链均为κ型。Pepscan分析结果显示,这2株单抗可分别识别EMCVVP2蛋白上的2个B细胞线性表位。本研究获得的蛋白十分接近于其天然构象,很大程度上保证了病毒表面抗原位点的结构和功能。 相似文献
16.
据猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,App）apxⅣ毒素基因5′端的保守区域设计一对特异性引物,应用PCR方法扩增出致病性App1~12血清型菌株的保守5′端序列片段,构建的重组质粒pETapxⅣN经IPTG诱导表达出分子量大小为35.3kDa的可溶性重组蛋白。以亲和层析试剂盒纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗ApxⅣ毒素单克隆抗体（McAb）。以间接ELISA法筛选到两株分泌稳定、抗体亚类均为IgGl的杂交瘤细胞5B7和5C11,其培养上清和小鼠腹水抗体效价分别为1∶64、1∶128和1∶64 000、1∶128 000.两株单抗与临床猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪呼吸道繁殖障碍综合征病毒、猪黄、白痢产肠毒素大肠杆菌和猪肺疫多杀性巴氏杆菌感染阳性血清均不发生交叉反应,显示出良好的特异性.竞争性结合试验表明两株单抗识别不同的抗原结合表位.以（NH4）2SO4盐析法纯化的5C11小鼠腹水单抗包被酶标板,生物素标记纯化的5B7单抗建立了检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA法,其包被单抗最佳工作浓度为4μg/ml,生物素标记单抗最佳工作浓度为0.8μg/mL,对重组表达ApxⅣ毒素（rApxⅣ）的最低检出量为60pg/mL。从10份临床病猪血清样本中检出6份ApxⅣ毒素阳性,与细菌分离鉴定和PCR结果相符合,结果表明此法可用于App感染的临床诊断。 相似文献
17.
采用RT-PCR技术从滨州分离株中扩增出传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP4基因,将VP4基因插入到pGEX-4T-1载体上构建pGEX-4T-1-VP4,诱导表达并用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和层析柱纯化得到纯化的重组VP4蛋白。以兔抗鸡IgG为胶体金标记物,以重组IBDV VP4蛋白和羊抗兔IgG为硝酸纤维素膜检测线和质控线的包被物,制备一种能检测IBDV VP4蛋白抗体的胶体金试纸条。结果表明,该试纸条检测IBDV强毒(IBDV BC6/85)免疫的血清检测线显红色,为阳性反应;检测IBDV弱毒(IBDV NB)免疫的血清、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)标准阳性血清、禽流感H5和H9标准阳性血清、传染性支气管炎标准阳性血清及0.85%生理盐水检测线不显红色,为阴性反应。该试纸条与建立的ELISA方法相比,敏感度低2个滴度;检测320份临床血清,试纸条与ELISA的符合率达99.38%。提示,该试纸条使用方便、操作简单,10 min内可以用肉眼判断结果,可为区分IBDV的强弱毒提供参考数据,具有较大的应用价值。 相似文献
18.
以禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的cDNA为模板,用PCR技术获得囊膜糖蛋白(env)基因的部分片段并构建了pGEX-4T-3-env表达质粒,进而在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白GST-env,SDS-PAGE证明表达的融合蛋白以包涵体的形式存在。融合蛋白经过变性、复性以及牛凝血酶酶切后得到纯化的目的蛋白env,免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性单克隆抗体(mAb),并通过间接ELISA、间接免疫荧光和Western blotting等方法对mAb做初步鉴定。结果表明,试验成功表达了env蛋白,并获得了4株稳定分泌针对env蛋白的杂交瘤细胞(3-2A11,1-2B3,1-2D11,3D2),其分泌的mAb的Ig亚类(型)分别为IgG2b,IgG2b,IgG2b,IgG1。ELISA检测,对应腹水的效价分别为1∶105,1∶2.1×105,1∶2.2×105,1∶105。Western blotting结果显示4株抗env的mAb均能特异性识别env蛋白,间接免疫荧光分析则表明只有3-2A11和3D2这2株mAb能与REV全病毒特异性反应。 相似文献
19.
将氟苯尼考胺与HSA载体蛋白相连作为抗原免疫Balb/c小鼠,经杂交瘤技术获得了两株能稳定分泌抗甲砜霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E及5C。用间接竞争ELISA方法测定,其细胞株1E单克隆抗体的细胞上清液效价为1∶5×103,腹水效价为1∶1×106,抗体亚类为IgG2b,50%抑制浓度(IC50)为15μg/L。其分泌的单克隆抗体与其结构类似物氟苯尼考及氟苯尼考胺的交叉反应率为10.4%和10.8%,和其他化合物基本无交叉反应。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定,可为检测试剂盒提供长期稳定的抗体。 相似文献