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鹿茸间充质干细胞是一类新发现的干细胞。为获得鹿茸间充质干细胞的生物学特征,建立鹿茸间充质干细胞体外培养模式,通过采用改良组织块细胞培养法对生长30 d的塔里木马鹿茸间充质层细胞体外分离培养,观察细胞形态特征,MTT比色法检测细胞生长特点。结果表明:间充质层样品组织块于1 d完全贴壁,贴壁后培养2 d即可观察到组织块边缘迁出少量细胞,贴壁后培养3 d,大量的间充质干细胞从组织块中迁出,并不断增殖,在组织块贴壁后5 d细胞生长融合。传代培养的2~6代细胞在培养到96 h细胞增殖达到高峰。原代培养细胞呈梭形,细胞核呈椭圆形,细胞呈菊花状排列生长;传代细胞形态呈梭形、不规则形,且排列无规则。本研究结果将为鹿茸间充质干细胞的后续研究奠定基础。 相似文献
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梅花鹿鹿茸间充质层细胞的体外培养和冷冻保存 总被引：2，自引：1，他引：1
为了研究梅花鹿鹿茸间充质层细胞的生物学特性,取梅花鹿鹿茸生长顶端间充质层组织,分离间充质层细胞进行体外培养及冷冻保存。结果表明:在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中,鹿茸间充质层细胞能进行短期体外培养,培养的细胞呈成纤维细胞样,培养7 d可长至汇合。以含5%二甲基亚砜(DMSO)和10%FBS的DMEM为冻存液,经梯度降温后冻存,间充质层细胞复苏后存活率较高。在4℃条件下,间充质层组织在含10%FBS的DMEM中可保存7 d。 相似文献
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《中国兽医杂志》2020,(1)
为马的关节炎、肌腱和韧带损伤的临床治疗提供种子细胞,本试验通过采集马颈部脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪间充质干细胞,并进行传代培养;绘制细胞生长曲线、测定细胞群体倍增时间;通过流式细胞术检测P3代细胞表面标记物,RT-PCR法扩增细胞表面标记物目的基因片段;油红O和茜素红染色法测定脂肪间充质干细胞的成脂和成骨诱导分化能力。结果发现:马脂肪间充质干细胞体外培养条件下呈长梭形和典型的旋涡状,生长状态良好、折光性强;经测定细胞生长曲线呈典型的"S"型,符合Logistic生长曲线规律;P3、P6和P9代细胞群体倍增时间分别为21.5 h、26 h、36 h;流式细胞术检测结果显示,P3代细胞高表达间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105,不表达造血系细胞表面标志物CD45;PCR扩增得到CD44、CD90、CD105和CD73特异性目的片段;油红O和茜素红染色证明,马脂肪间充质干细胞具有成脂和成骨诱导分化能力。 相似文献
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试验旨在从塔里木马鹿鹿茸顶端组织中克隆血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的编码序列,分析其分子特性及其在鹿茸组织中的表达情况。本研究采用改良的Trizol法提取鹿茸顶端组织总RNA,以RT-PCR方法获得VEGF基因,回收纯化后连接到pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并鉴定,利用免疫组化法确定VEGF蛋白在塔里木马鹿鹿茸顶端组织茸皮层、间充质层和软骨层中的表达水平。结果显示,VEGF基因开放读码框（ORF）全长为648 bp,编码216个氨基酸。通过其序列比对和进化分析发现,塔里木马鹿茸中VEGF与人、牛、羊、猪的VEGF核苷酸序列同源性分别为98.75%、96.55%、97.58%和97.56%,其中与人VEGF同源性较高。免疫组化试验表明,塔里木马鹿VEGF蛋白在间充质、茸皮层和软骨中均有表达,但无明显表达差异。说明塔里木马鹿鹿茸可能会是人类研究再生医学和血管相关疾病的理想模型,同时,本研究为不同发育期塔里木马鹿鹿茸再生干细胞比较蛋白质组学研究提供了基础试验数据。 相似文献
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《黑龙江畜牧兽医》2016,(1)
鹿茸作为一种贵重中药,对人体有滋补作用,尤其在治疗虚弱、神经衰弱等方面效果更佳。鹿茸角是通过生茸干细胞的快速分裂和繁殖实现的,而这种鹿茸干细胞主要分布于鹿茸周围的骨膜组织中,随着鹿茸的逐渐长大,骨膜组织向间充质组织转化,而此时这之间的间充质细胞也仍然具有干细胞的特点,在体内也可以向软骨组织转化。而干细胞自身不仅具有进行复制、更新的能力,同时还具有在一定条件下"变身",即通过分化成为多功能细胞的能力。结果表明:间充质干细胞(MSC)是成体干细胞的一种,它的自我更新受自身内在基因和其所处微环境信号的共同调控。而其中的Notch、Wnt 2条有关发育调控的信号,则在这两种能力的调控过程中具有至关重要的作用。 相似文献
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为获得犬脂肪间充质干细胞,本试验取犬腹股沟皮下脂肪组织,分别利用组织培养法和酶消化法分离犬脂肪来源间充质干细胞,对比观察不同来源细胞的形态和增殖特征,并通过诱导液促进细胞向成骨细胞和成脂细胞方向分化,检测其分化潜能。结果表明,通过组织培养法培养的青年犬脂肪组织,可获得大量脂肪间充质干细胞,该细胞生长旺盛,形态均一,可分化为碱性磷酸酶染色阳性的成骨细胞和油红O染色阳性成脂细胞。组织培养法分离培养犬脂肪间充质干细胞操作简单,可为细胞移植治疗等研究提供充足的细胞来源。 相似文献
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本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs),为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3～5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。 相似文献
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崂山奶山羊脂肪间充质干细胞系的建立及鉴定 《畜牧与饲料科学》2018,39(12):1-5
旨在建立崂山奶山羊脂肪间充质干细胞系并对其进行初步鉴定.采集崂山奶山羊脂肪组织,在Ⅰ型胶原酶的分解消化作用下,将脂肪组织中的单核细胞进行分离并扩增培养;测定其生长曲线,利用Real time RT-PCR技术对其表达的干细胞因子进行鉴定;将传至第3代的脂肪间充质干细胞进行成骨诱导分化,利用茜素红染色进行鉴定.结果显示,崂山奶山羊脂肪间充质干细胞形态为长梭形、星形等成纤维细胞样细胞形态,但比成纤维细胞饱满,第3代细胞生长至3 d左右时细胞进入指数生长期,生长至6~7 d时进入平台期;经成骨诱导分化后,经茜素红染色可见骨结节被染成深红色.综上提示,崂山奶山羊脂肪间充质干细胞具有诱导分化潜能. 相似文献
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TGF-β信号是刺激骨形成重要的旁分泌信号通路,Wnt信号是细胞生长和分化的重要通路,为探究两信号通路对鹿茸间充质干细胞软骨分化的影响,实验利用10 ng/mL TGF-β1刺激鹿茸间充质干细胞软骨分化,利用定量PCR与Westernblot技术检测分化过程Wnt家族16个生长因子及通路关键基因DKK1和β-catenin的表达变化。结果表明:刺激后第7天细胞开始分泌软骨的表面标志物,软骨分化开始,至第21天骨分化开始;分化过程中检测到Wnt3、Wnt4和Wnt5A 3个Wnt家族生长因子的表达,且Wnt3与Wnt5A基因的表达趋势相近,即在刺激后的第21天达到最高;Wnt4基因表达从软骨与骨的形成阶段呈上调表达趋势,DKK1基因在软骨发育的关键时期即第21天高表达,而β-catenin作为信号通路的枢纽在该时间点呈下调表达。由此可见,Wnt信号通路对塔里木马鹿茸MSCs软骨分化起重要的调控作用,Wnt家族的Wnt3和Wnt5A基因对软骨分化有重要作用影响,而Wnt4基因对软骨骨化有重要影响。 相似文献
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为探讨原癌基因c-fos对鹿茸生长的调控作用,采用3头成年塔里木马鹿Cervus elaphus生长期为30、60d的新鲜鹿茸,剖分成茸皮层、间充质细胞层、成软骨细胞层和软骨细胞层。首先用2种免疫组化的方法进行基因表达定位,然后通过荧光定量PCR技术对不同组织基因的表达进行定量分析。免疫组化分析结果表明,该基因在茸皮的毛囊内根鞘和毛母质及皮脂腺、动脉血管的环形平滑肌处呈阳性反应;真皮乳头层与表皮基部连接的基底层呈阳性反应。在静脉血管、神经和其他附属器反应均未观察到阳性细胞。在间充质细胞层、成软骨层和软骨层2种方法均没有观察到c-fos的阳性表达细胞。定量分析发现,c-fos基因在不同生长阶段不同组织层均有表达,且在茸皮的表达量显著的高于间充质细胞层,成软骨层和软骨层(P<0.05)。在同一生长期间充质细胞层、成软骨层和软骨层c-fos的表达量很低;生长30与60d比较,c-fos在间充质细胞层和成软骨层变化不大,在茸皮层和软骨层表现为下调表达。本研究表明c-fos基因在鹿茸快速生长期参与了茸皮干细胞的增殖与分化,并对成骨细胞的分化起着调控作用。 相似文献
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本研究旨在优化组织培养法分离小鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,为研究成骨分化和成脂分化在间充质干细胞分化过程中的相互影响奠定基础。通过细胞形态学观察、细胞生长曲线和流式仪器检测所分离获得的间充质干细胞的特性,利用CRISPR-dCas9系统在快速促进间充质干细胞成骨分化的前提下观察其对成脂分化的影响,并通过生化染色、实时荧光定量PCR和免疫细胞学等手段进行分析。结果显示,接种3~5 d后可见细胞从组织块周围爬出,光镜下可见细胞形态多为成纤维细胞样的梭形细胞,且形态单一均匀,具有较高的爬出率,可以大大提高脂肪间充质干细胞的分离效率;通过CRISPR-dCas9系统激活Runx2和Osterix基因后可以促进间充质干细胞的成骨分化,实时荧光定量PCR及油红O染色结果显示,CRISPR-dCas9系统可以同时抑制间充质干细胞的成脂分化;通过CRISPR-dCas9-KRAB系统同时抑制成骨相关基因Runx2和Osterix后可以促进成脂分化。本研究利用组织贴壁法成功获得了高纯度的脂肪间充质干细胞,具有间充质干细胞的特性和分化能力;利用CRISPR系统可以同时过表达Runx2和Osterix两个基因,可以在进成骨分化的同时抑制成脂分化,表明成脂分化和成骨分化的相关性,为基因编辑在间充质干细胞诱导分化和临床应用方面提供了新的思路和方法。 相似文献
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为探讨原癌基因c-myc对鹿茸生长的调控作用,选择3头成年塔里木马鹿生长期为30、60d的新鲜鹿茸,剖分成茸皮层、间充质细胞层、成软骨细胞层和软骨细胞层。首先用2种免疫组化的方法进行基因表达定位,然后通过荧光定量PCR技术对不同组织基因表达定量进行分析。结果显示：该基因在茸皮的毛囊内根鞘、毛母质和皮脂腺呈阳性反应,在动脉血管的环形平滑肌、真皮乳头层与表皮基部连接的基底层呈阳性反应。在静脉血管、神经和其他附属器反应均呈阴性。定量分析结果表明c-myc基因在不同生长阶段不同组织层均有表达。茸皮层从生长期30～60d,c-myc表达下调,而在其他3个组织中均上调表达;同一生长期茸皮和软骨层的表达量均高于间充质细胞层和成软骨层（P〈0.05）;不同生长期30、60d组织间基因的表达没有显著的变化。研究结果表明,c-myc基因在鹿茸快速生长期参与了茸皮的增殖与分化;在软骨组织中高表达特别是生长后期,说明原癌基因c-myc对马鹿茸软骨发育及骨形成有着一定调控作用。 相似文献
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快速生长期和骨化期梅花鹿茸生长中心间充质组织的差异表达基因筛选 总被引：1，自引：0，他引：1
《黑龙江畜牧兽医》2018,(24)
为了研究东北梅花鹿茸不同生长时期生长中心间充质组织基因表达变化,试验采用Illumina测序技术和生物信息学方法对快速生长期和骨化期鹿茸生长中心间充质组织进行转录组测序、组装、比对和差异基因表达分析。结果表明:从快速生长期和骨化期鹿茸间充质组织中分别获得4. 45 Gb和4. 47 Gb的测序数据,测序质量值、Q20值分别为98. 39和98. 75;通过Trinity软件组装,分别获得40 963条和39 315条组装序列,平均长度分别为1 121,1 139 nt;通过与蛋白数据库进行比对和差异基因表达分析筛选出调控鹿茸快速生长和骨化的差异表达生长因子10种,差异表达转录因子13种和差异表达胶原15种。说明鹿茸快速生长和骨化受多种生长因子、转录因子和胶原分子的调控,这些生长调控因子的表达差异性与鹿茸的再生、快速生长及骨化过程存在着极大的相关性。 相似文献
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以梅花鹿为研究对象,通过流式细胞术、荧光定量PCR等方法,探讨YAP(Yes-associated protein,即Yes相关蛋白)对鹿茸间充质细胞增殖与分化的影响。分离培养鹿茸间充质细胞,添加一定浓度的YAP抑制剂Verteporfin后,通过流式细胞术检测发现,细胞的增殖活性被显著抑制,G0/G1期细胞百分比增加,S期细胞百分比降低。同时,Verteporfin可降低CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4和CDK6在鹿茸间充质细胞中的表达。Verteporfin处理12,24,36,48,72 h后,软骨细胞标志性分子COLⅡ、SOX9和AGC的表达显著增强。进一步研究了YAP对间充质细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的影响,结果显示Verteporfin可增加间充质细胞中ROS含量,促使细胞中超氧阴离子(O2-)和线粒体ROS(mtROS)含量升高。为了探究YAP是否通过ROS来影响鹿茸间充质细胞的分化,细胞经Verteporfin处理2 h后再添加抗氧化剂GSH和NAC处理24 h,结果显示GSH和NAC可显著减低Verteporfin对COLⅡ、SOX9和AGC mRNA的诱导效应。结果表明,YAP在鹿茸间充质细胞的增殖与分化过程中起重要作用。 相似文献
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为建立崂山奶山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)永生化细胞系,将已构建的pcDNA3.1-EGFPTERT转入崂山奶山羊BMSCs中,利用含G418的培养基筛选获得稳定转染的TERT-BMSCs;通过多次传代,测定其生长曲线;选取高代次TERT-BMSCs的分裂中期相的细胞,检测其染色体及核型的稳定性。结果表明,转入TERT基因的崂山奶山羊BMSCs能够稳定表达该基因,其生长曲线呈"S"形;在多次传代后,P40代细胞的核型正常率仍能达到88.24%。综上提示,转染得到的TERT-BMSCs具有良好的生长状态,其细胞生长稳定,符合永生化细胞特征,为间充质干细胞应用于组织修复及基因工程种子细胞的制备提供了理论基础。 相似文献
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本研究旨在观察不同代次骨髓间充质干细胞(BMSCs)和脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外培养的生长特点和体外诱导成骨能力。通过密度梯度离心和贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞,用含地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化,并利用茜素红染色、碱性磷酸酶染色及PCR方法检测成骨细胞。结果表明骨髓及脂肪间充质干细胞呈成纤维细胞样生长,增殖能力强,生长迅速。第5、10、15、20代BMSCs及ADSCs经诱导培养后茜素红染色呈阳性并且出现"矿化"、碱性磷酸酶活性强,随着细胞代次的递增,诱导后细胞碱性磷酸酶活性呈递减趋势;诱导后的两类细胞传代后细胞仍能继续分化,并形成正常的"矿化"结节,且碱性磷酸酶染色均弱于初次诱导。结果提示,BMSCs及ADSCs易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨能力强且成骨细胞传代培养仍具有成骨能力,适合作为再生医学骨组织工程的种子细胞。 相似文献