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1.
本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。 相似文献
2.
《上海畜牧兽医通讯》2015,(4)
为了建立一种快速的鸡马立克氏病血清1型病毒(MDV-1)病原检测方法,试验采用针对MDV-1基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测MDV-1核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)均不发生交叉反应;该方法可检测到4.6×101拷贝/L的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明所建立的Real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于MDV-1的定量检测。 相似文献
3.
针对J亚群禽白血病病毒（ALV-J）基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒作为阳性标准品,建立了检测ALV-J核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如A亚群禽白血病病毒（ALV-A）、B亚群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、鸡传染性贫血病毒（CIAV）和马立克病病毒（MDV）均不发生交叉反应;该方法可检测到3.2×102拷贝/μL的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR 检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于ALV-J的定量检测。 相似文献
4.
《中国家禽》2019,(22)
利用禽脑脊髓炎病毒(Avian encephalomyelitis virus,AEV)YBF02株VP1基因序列设计一对特异性引物,通过对反应体系条件的确定和阳性质粒标准曲线的建立,建立了用于快速检测AEV含量的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR。结果显示:该方法能特异性地检测AEV YBF02株,且与其他禽类病毒无交叉反应;敏感性试验表明,该方法最低能检出10拷贝的AEV RNA模板,为普通PCR的100倍;使用该方法和鸡胚半数感染量(EID50)法对样品进行检测,二者具有良好的线性关系,且重复性试验的变异系数均小于4%。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR敏感性高、特异性强、重复性好,为AEV含量的快速检测提供了一种新的技术手段。 相似文献
5.
为了建立一种快速的新城疫病毒(NDV)病原检测方法,试验针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法建立了检测IBV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和反应条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果表明:该检测方法特异性强,与其他禽源病毒如NDV、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.1×101拷贝/μL的病毒核酸,比常规RT-PCR的敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。说明研究建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于IBV的定量检测。 相似文献
6.
针对新城疫基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测NDV核酸的荧光定量PCR方法,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如鸡传染性支气管炎(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克氏病毒(MDV)均不发生交叉反应;该方法可检测到3.9×101拷贝/!L的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于3%。结果表明,本研究所建立的Real-time RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于新城疫的定量检测。 相似文献
7.
本研究建立了一种快速的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52株定量检测方法,为进一步研究疫苗的效价检测和质量监控新方法奠定基础。针对IBV核蛋白(N)基因,设计特异的H52株荧光定量PCR检测引物和TaqMan-MGB探针,优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验,探讨荧光定量RT-PCR与EID50方法测定病毒含量的相关性,并通过体外转录技术对病毒基因拷贝数进行定量分析。该方法特异性强,与其他禽源病毒均无交叉反应;该方法可检测到5.60×101拷贝/μL的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高10倍;重复性试验的变异系数为0.9%~3.2%;与EID50检测结果的相关系数r＝0.934,两种方法在检测H52株病毒效价上具有很好的相关性。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法,适合于对鸡传染性支气管炎病毒H52株病毒含量的快速定量检测。 相似文献
8.
为建立一种能够快速、灵敏和特异地检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,本研究以ALV-J原型病毒株HPRS-103的pol基因3′端与gp85编码基因之间的保守区域(5 258 bp～5 802 bp)为检测目的片段,构建重组质粒并作为靶基因,通过对其浓度、引物浓度和退火温度的优化,建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法.结果显示该方法的最低检测限度为2.36×102拷贝/μL,比普通PCR高100倍;与其他禽源病毒无交叉反应;批内和批间变异系数均小于5％.表明本研究建立的方法具有良好的特异性、稳定性和灵敏性.采用该方法对100只临床病鸡进行检测,ALV的检出率为44％.随机选择10只感染阳性鸡,检测病毒基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的分布与表达水平,结果表明ALV-J在各主要脏器中均有分布,但以肾脏中的病毒表达量最高. 相似文献
9.
抗J亚群禽白血病病毒囊膜糖蛋白特异性单克隆抗体的研制及其特性 总被引：12，自引：0，他引：12
J亚群禽白血病病毒（ALV-J）是一种主要感染肉用型鸡的反转录病毒。本研究用表达ALV-J囊膜蛋白基因产物的Sf9细胞免疫Balb/c小鼠，取其脾脏细胞与骨髓瘤细胞NS1进行融合，获得了4株特异性抗ALV-J的单克隆抗体。免疫荧光分析结果表明，3株单克隆抗体仅与所试验的ALV-J毒株反应，而不能与ALV的A、B、C、D和E亚群的毒株反应。有趣的是，有一株单克隆抗体可以与所有试验的外源性ALV毒株反应，但不与内源性的E亚群反应。Western Blot和免疫沉淀试验结果表明，单克隆抗体识别的ALV-J囊膜糖蛋白的分子量为90-94kD，识别未糖基化的囊膜蛋白分子量约为53kD。用这些单克隆抗体能检测出ALV-J病毒感染鸡胚成纤维细胞中的病毒抗原。这些结果提示这些单克隆抗体可用于ALV-J疾病的诊断和流行病学调查。 相似文献
10.
817肉杂鸡肉瘤组织分离出A、J亚型禽白血病病毒 总被引：5，自引：1，他引：4
山东某地饲养的36日龄817肉杂鸡生长迟缓并发生颈部肉瘤。取肉瘤组织上清液接种CEF,培养12d,用IFA试验进行病毒鉴定。检测结果表明,从该肉瘤组织分离到A亚型与J亚型禽白血病病毒(ALV-A、ALV-J),命名为SD1005株。取肉瘤组织上清液人工感染817肉杂鸡与SPF鸡进行动物回归试验,结果复制出同样肉瘤。用复制出的新鲜肉瘤分别制备肉瘤细胞与肉瘤组织触片,IFA试验再次验证出ALV-A与ALV-J均为阳性,而且发现ALV-A与ALV-J分别共感染同一个组织细胞。同时,通过PCR方法用针对ALV-A、ALV-J的2对引物扩增并鉴定出肉瘤组织中含有ALV-A、ALV-J。对扩增的ALV-J囊膜糖蛋白(env)基因1 710bp片段进行的遗传变异分析结果显示,SD1005株与14株国内外参考株之间的同源性为88.5%～94.0%,其中与来自白羽肉鸡的美国参考株0661(AF247566)、ADOL-Hc1(AF097731)的同源性最高,分别为94.0%、93.8%。本研究显示,来自817肉杂鸡的肉瘤组织上清液接种鸡可诱发急性肉瘤,其中既检出ALV-A,又检出ALV-J,但急性肉瘤由单个病毒诱发还是与共感染... 相似文献
11.
研究通过比对鸽源和鸡源新城疫病毒M基因的序列,找到其差异位点并在保守区设计引物和TaqMan探针,建立了一种可以特异性检测鸽新城疫病毒的实时荧光定量PCR方法。以鸽新城疫病毒M基因阳性质粒为模板制作标准曲线并对检测方法的指标进行系统评价。结果显示,该方法的标准曲线为方程为:y=-3.334logX+37.837,相关系数R2=0.992;重组质粒标准品检测下限为1×101 copies/μL,比普通PCR灵敏100倍;特异性试验显示,该方法与鸡新城疫病毒不同毒株及其他常见禽类病毒无交叉反应;重复性试验的组间及组内的变异系数均小于2%,说明本研究建立的实时定量PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,可应用于鸽新城疫病毒的早期检测,为鸽新城疫病毒的防控提供了技术支持。 相似文献
12.
为探究江苏地方品种JS鸡种易发肿瘤病的原因,本研究从病原学方面进行相关分析。通过剖检发现JS鸡疑似发生肿瘤病;观察组织切片发现禽白血病病毒(ALV)、马立克病毒(MDV)引起其的特征性病变;分别应用2对可区分MDV野毒和疫苗毒的鉴别引物、1对ALV群特异性引物、5对可区分不同亚型ALV的鉴别引物,以及3对网状内皮组织增生症病毒(REV)特异性引物对病料样品和细胞培养物进行PCR检测;同时,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测培养细胞中的禽REV,ELISA检测细胞上清中ALV-p27抗原。检测结果显示,鉴定出的MDV为血清1型MDV野毒,ALV为J亚型(ALV-J),REV为阴性。采集同群发病鸡血液分离MDV、ALV-J,将获得的病毒株人工接种1日龄SPF鸡,感染后5 d自实验鸡血液中分离到MDV、ALV-J,表明该分离株可感染SPF鸡,具有良好的生物学活性。本研究从JS品种鸡中检测到了致瘤性病毒MDV和ALV-J,这可能是该品种鸡肿瘤病多发的主要原因之一,这一研究结果对JS鸡肿瘤病的防制提供了科学依据。 相似文献
13.
为了建立灵敏、特异的H7亚型禽流感病毒(AIV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法，本研究根据GenBank和GISAID中H7亚型AIV血凝素(HA)基因的核苷酸序列，设计合成H7亚型AIV的引物和探针，对反应条件进行优化，从而建立检测H7亚型AIV的ddPCR方法，并测定其特异性、敏感性和重复性。结果显示，最佳引物浓度和探针浓度分别为900 nmol/L和250 nmol/L,最佳退火温度为55℃,最佳升降温速率为2.0℃/s,最佳反转录时间为20 min。特异性试验结果显示，该方法仅对H7亚型AIV进行特异性检测，对H5亚型AIV、H9亚型AIV、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒均不能检出。敏感性试验结果显示，该方法对重组质粒标准品检测下限为0.8 copies/μL,比荧光定量PCR(qPCR)方法敏感性高10倍。组内和组间重复性试验结果显示，变异系数均小于3%。对60份临床样品检测显示，该方法与鸡胚分离方法的符合率为100%。结果表明，本研究建立的H7亚型AIV ddPCR检测方法具有较好的特异性、重复性和敏感性，可用于H7亚型AIV的早期诊断、流行病学... 相似文献
14.
《黑龙江畜牧兽医》2017,(15)
为了建立一种能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和轮状病毒(RV)的多重实时荧光定量PCR方法,试验根据PEDV CV777株、TGEV Purdue P115株全基因序列和RV OSU毒株的VP6基因序列,设计出3对特异性引物及探针,优化反应条件,开展特异性、敏感性、重复性和验证试验。结果表明:该方法的检测最低限为1×10~2拷贝/μL的RNA标准品或1×10~(-2)TCID_(50)/mL的疫苗毒,具有较高的敏感性;变异系数均小于10%,符合统计学要求;利用本试验所建立的方法以及商品化试剂盒对20份临床样品进行检测,符合率为100%。说明本试验建立的方法特异性好,敏感性高,重复性稳定,可用于PEDV、TGEV和RV的鉴别诊断和防控。 相似文献
15.
《中国兽医学报》2020,(3)
根据K亚群禽白血病病毒(ALV-K)gp85基因序列设计1对引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ALV-K的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法在1～10~7 copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到1 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。该方法与经典亚群ALV及其他常见禽免疫抑制病病毒无交叉反应,批间与批内重复性试验变异系数均小于2%。将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊接种途径感染SPF鸡,运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法,对感染鸡体内各器官的病毒分布及病毒载量进行了检测。结果显示,在感染鸡的心脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官中均可检测到病毒,其载量无明显差异。结果表明,本试验所建立的实时荧光定量PCR方法具有敏感度高、特异性强和重复性好的优点,可用于ALV-K的快速、定量检测,该方法同时为ALV-K致病机制的研究提供了良好的技术手段。 相似文献
16.
鹅星状病毒RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
《现代畜牧兽医》2021,(4)
为建立一种鉴定鹅星状病毒(GAstV)的RT-PCR方法,试验根据GenBank中GAstV ORF1b基因序列设计1对特异性引物,构建重组质粒pMD18-T-GAstV,以其作为标准品建立GAstV的RT-PCR检测方法。通过对GAstV及其他4种病毒进行检测,优化其反应条件并进行特异性、敏感性和重复性试验以及临床样本检测。结果显示,除GAstV外,鹅细小病毒(GPV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)、鸡病毒性关节炎(AVAV)、坦布苏病毒(TmuV)等常见禽病病原利用该方法检测均呈阴性,表明其特异性良好;建立的RT-PCR检测方法的最低检出限可达5.5×10~3,敏感性较高;重复性试验显示其重复性良好。利用该方法对10份人工模拟病料进行检测限LOD分析,阳性样品10倍系列稀释浓度。结果表明,最低检出限可达1.21×10~3copies/μL。研究表明,成功建立了一种鉴定GAstV的RT-PCR方法,且该方法具有快速、廉价、特异性强、敏感性高和重复性好的优点,可用于GAstV的临床诊断。 相似文献
17.
《中国预防兽医学报》2020,(5)
为快速检测鸡群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)感染状态,本研究针对鸡群中主要流行的外源性ALV亚群ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K,设计通用上游引物PF和特异性下游引物AR、BR、JR和KR,通过构建质粒标准品,对最适引物浓度、退火温度及循环数等反应条件进行优化,建立了能同时检测ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的多重PCR方法,进一步对其特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示,采用0.2μmol/L PF、0.1μmol/L AR、0.1μmol/L BR、0.1μmol/L JR和0.1μmol/L KR,56.0℃退火温度和30个循环的反应条件建立的多重PCR方法检测效果最优。该方法能特异性地检测出ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的单一或混合感染,而对其它禽源病毒无特异性扩增;该方法对质粒标准品的检测下限为1×103拷贝/μL,敏感性较高;利用该方法对3个浓度混合质粒模板的检测,显示出良好的批内和批间重复性。利用本研究建立的多重PCR方法与传统病毒分离方法对96份表观健康鸡抗凝血样品及21份肿瘤组织样品进行检测,结果显示该多重PCR方法检出率更高,二者符合率99.1%。利用建立的多重PCR方法检测119份ALV阳性样品,结果显示,单一感染ALV-J检出率最高(43.7%),其次为ALV-K(17.6%);除单一感染外,地方品种鸡群还存在ALV-B+J、ALV-J+K的二重感染,以及ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K的三重感染。本研究为禽白血病流行病学调查及外源性ALV初步鉴定提供了技术支撑。 相似文献
18.
鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
根据鸡传染性贫血病毒基因组保守区域设计1对扩增片段为164 bp的特异性引物,应用SYBR GreenⅠ染料建立了鸡传染性贫血病毒(CIAV)荧光定量PCR检测方法.以本室构建的阳性重组质粒作为模板,制定标准曲线,对CIAV阳性样品进行了敏感性、特异性和重复性、稳定性试验,并应用于临床检测.结果表明引物最佳终浓度为0.2 μmol/L,制作的标准曲线定量浓度范围宽,最低可检测到每个反应相当于10个拷贝的标准品DNA;与IBDV、ARV、MG都不反应;重复性、稳定性试验的变异系数都较小.对保存的25份疑似CIAV样品进行荧光定量PCR检测,结果检出9份阳性.本研究建立的荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上鸡感染CIAV的检测. 相似文献
19.
《中国家禽》2021,(5)
为建立一种快速定量检测鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)的方法,试验针对H120株5′端非编码区保守区域序列设计一对特异性引物,构建重组质粒作为阳性标准品进行SYBR GreenⅠReal-time PCR,建立了定量检测IBV的标准曲线与直线回归方程;同时,应用该方法检测三株IBV毒株在接种SPF鸡胚后不同时间段的病毒含量。结果显示:该方法标准曲线相关系数为1,线性曲线好;最低可检测病毒的浓度为10~1拷贝/μL,是常规PCR方法的100倍;与其它禽源病毒均不发生交叉反应,特异性好;批间和批内重复性试验变异系数均小于1%;病毒含量在接种后36 h达到峰值,且rH120-S/TZ株病毒复制效率高于H120株,rIBTZ株复制效率最低。结果表明,该Real-time PCR方法灵敏度高,特异性和重复性好,可应用于IBV的定量检测。 相似文献
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参照GenBank中已发表的H7亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因设计合成了一对预计扩增片段大小约为310bp的引物。利用这对引物,通过对RT-PCR反应体系和反应条件的优化,建立了针对H7亚型禽流感的RT-PCR检测方法。敏感性试验和特异性试验结果表明,该方法敏感性高,最低可检出100pg的AIV-H7的mRNA,且应用该引物对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)及其他亚型的流感病毒(H1、H3、H5、H9)在相同反应条件下未扩增出任何片段,具有较好的特异性。用所建立RT-PCR方法检测发病鸡组织病料及咽、肛拭子,检测结果与鸡胚病毒分离结果相比,阳性符合率高达90.6%。 相似文献