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1.
将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值. 相似文献
2.
猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性测定 总被引：1，自引：0，他引：1
利用基因工程技术,将编码梅山猪α-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNα,501 bp)亚克隆到含分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNα。用化学方法(LiCl)将线性化的mPoIFNα与ssDNA共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后,得到的阳性菌株再以高浓度的G418筛选多拷贝重组子。该高拷贝菌株经1%甲醇连续诱导4 d,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,结果表明在毕赤酵母中猪α-干扰素获得分泌型表达,表达产物约为20 000,在GS115中的表达量约为40mg/L,占GS115表达的可分泌型总蛋白的40.1%。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性抗猪α-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,试验结果表明rPolIFNα具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为8.0×106U/mg。 相似文献
3.
从重组克隆栽体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPICgK相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用SaIⅠ线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31 000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别. 相似文献
4.
袁芳艳;刘泽文;周丹娜;杨克礼;段正赢;郭锐;田永祥 《湖北畜牧兽医》2013,(9):5-8
利用RT-PCR扩增H1N1亚型猪流感病毒HA基因,亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建分泌型重组表达载体pPIC9K-HA。将线性化的pPIC9K-HA电转化毕赤酵母菌GS115。将经MD平板筛选和PCR鉴定的阳性菌株用G418筛选多拷贝重组子。最后用1%甲醇诱导表达重组子,经SDS-PAGE和Western-blot检测,H1N1亚型猪流感病毒HA基因在毕赤酵母中成功得到了表达,产物约60.4KD,并具有免疫活性。本研究为进一步研究猪H1N1亚型猪流感病毒HA基因的功能及检测方法奠定了基础。 相似文献
5.
猪带绦虫TS018基因真核表达载体的构建及其表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用PCR从重组克隆载体pGEM—TSO18中扩增出猪带绦虫六钩蚴TSO18基因，与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9k相连接，构建重组表达载体pPIC9k—TSO18，转化大肠埃希氏菌JM109，经测序证实，基因序列完全正确。制备重组质粒pPIC9k—TSO18，用SalⅠ线性化，并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合。采用G418抗性梯度法筛选得到高拷贝重组菌株，以甲醇进行诱导表达，SDS—PAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清中表达出具有反应活性的16ku重组蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的80％以上，诱导72h目的蛋白表达量为0．5mg／mL。 相似文献
6.
为了高效表达分泌型的猪β-干扰素,将去除信号肽的编码梅山猪β-干扰素成熟多肽基因(mPoIFNβ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC9K,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-mPoIFNβ。将以SalⅠ线性化的pPIC9K-mPoIFNβ用化学方法(LiCl),与鲑鱼精DNA(ssDNA)共转化入毕赤酵母菌株GS115,转化子经MD平板筛选和PCR鉴定后获得阳性菌株,再经高浓度G418筛选到多拷贝菌株。以1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明:表达产物为22 ku和26 ku的混合物,在GS115中的表达量约为80 mg/L,占分泌型总蛋白的29.4%~30.8%,表明猪β-干扰素基因在毕赤酵母中获得了高效分泌表达。对表达产物进行理化分析发现,重组酵母菌表达的蛋白耐酸(pH2),对热(56℃)部分敏感,并能被特异性的抗猪β-干扰素抗体中和而不与抗猪γ-干扰素抗体反应。以细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素抗病毒活性,在MDBK(牛肾细胞系)中表达的猪β-干扰素的抗VSV比活性达到2.0×106U/mg;对口蹄疫病毒在IBRS-2细胞中的增殖也有明显的抑制作用。 相似文献
7.
《动物医学进展》2021,42(4)
为防控猪流行性腹泻病毒(PEDV)病的流行,构建了靶向PEDV NB3-NB6-Fc纳米抗体融合蛋白的真核表达载体,并探究能否在毕赤酵母中分泌表达。通过实验室保存的pUC57-NB3-NB6-Fc质粒,成功构建分泌表达载体pPIC9K-NB3-NB6-Fc,经SacⅠ酶将其线性化并电转化入毕赤酵母GS115菌株。经过MD、梯度G418-YPD平板和PCR方法筛选多拷贝阳性重组转化子。经鉴定为阳性重组菌株用8 mL/L甲醇在29℃条件下诱导72 h,用SDS-PAGE和Western blot方法检测上清液中重组蛋白的表达情况。结果显示,成功诱导出大小为53.2 ku的分泌型重组蛋白,经Swiss-model在线预测该蛋白具有相对紧密的空间结构。成功获得pPIC9K-NB3-NB6-Fc-GS115分泌表达菌株,可为PED的预防和治疗提供材料。 相似文献
8.
用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础. 相似文献
9.
本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。 相似文献
10.
猪γ-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒作用 总被引：3，自引：0，他引：3
为了获得高效分泌表达重组猪γ-干扰素(rPoIFNγ),将去除信号肽的编码梅山猪γ-干扰素成熟蛋白基因(mPoIFNγ)插入酵母-大肠杆菌穿梭载体pPIC 9K中,构建成分泌型重组表达载体pPIC 9K-mPoIFNγ.将线性化的pPIC 9K-mPoIFNγ以化学方法(LiCl)转化入毕赤酵母菌株GS115(组氨酸缺陷型),转化子经MD平板筛选和PCR分析鉴定后,以G418(4 g/L)筛选到多拷贝菌株.SDS-PAGE和Western-blot检测结果表明,所获得的重组子能够分泌表达出17 000和23 000左右的mPoIFNγ特异蛋白,其表达量约为120 mg/L,占分泌型总蛋白的65%;细胞病变抑制法(CPE50)测定干扰素生物活性,结果表明rPolIFNγ具有较高的抗病毒生物活性,在MDBK中的抗VSV比活性为1.67×106 U/mg. 相似文献
11.
利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。 相似文献
12.
根据已发表的蛔虫抗菌肽cecropin P1基因编码序列设计引物,采用RT-PCR方法从猪肠道蛔虫中扩增出cecropin P1基因,并将其插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽下游的SnaBⅠ和NotⅠ位点之间,构建成cecropin P1基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/cecropin P1。载体经SalⅠ酶切线性化,电转化到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中,然后利用以葡萄糖为碳源的培养基（MD）和以甲醇为碳源的培养基（MM）筛选出组氨酸His＋型和甲醇利用正型（Mut＋）酵母重组体,再经G418加压筛选得到高拷贝cecropin P1基因的重组酵母。经PCR检测证明cecropin P1基因已整合到毕赤酵母的染色体中。重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,通过Tricine-SDS-PAGE检测,重组酵母能够分泌表达重组cecropin P1,同时表达的cecropin P1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。 相似文献
13.
应用特异性引物,从鸽新城疫F基因重组质粒pMD-18T-PPMV-1-F中PCR扩增F基因,用EcoRⅠ和NotⅠ分别对扩增产物和酵母表达质粒pPIC9K进行双酶切,将F基因定向克隆到pPIC9K的EcoRⅠ和NotⅠ位点,构建重组质粒pPIC9K-PPMV-1-F,对重组质粒鉴定后用SalⅠ酶切使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中,影印接种法筛选G418抗性菌株,提取酵母染色体DNA进行PCR鉴定,筛选出鸽新城疫F基因的高拷贝重组菌株。 相似文献
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本试验旨在研究β-1,3-1,4葡聚糖酶双拷贝基因毕赤酵母工程菌株的构建及发酵。首先,通过对质粒pGAP-glu-opt进行PCR扩增获得密码子优化的β-1,3-1,4葡聚糖酶基因glu-opt,用EcoR I和Not I双酶切后与毕赤酵母表达载体pPIC9K连接,获得重组质粒p9K-glu-opt。该重组质粒经Sac I线性化后转化毕赤酵母GS115菌株,利用不含组氨酸的MDS平板和摇瓶培养,筛选重组菌株,命名为GS115/9K-glu-opt。制备GS115/9K-glu-opt感受态细胞,再用线性化的重组质粒pPIC-glu-opt二次转化,在含有抗生素Zeocin的YPDS平板上筛选glu-opt基因双拷贝重组菌株GS115/2xglu-opt。双拷贝重组菌在10 L发酵罐中进行高密度发酵培养及甲醇诱导表达,β-1,3-1,4葡聚糖酶最高酶活达到21 600 U/mL,约为单拷贝工程菌株X33/pPIC-glu-opt发酵活力的1.44倍;蛋白表达量达8.4 g/L,约为X33/pPIC-glu-opt的1.68倍。 相似文献
15.
SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。 相似文献
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将牛病毒性腹泻病毒(BVDV)河北分离株HB-bd毒株E2基因去除跨膜区获得sE2基因,将sE2基因克隆入巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中,筛选培养后提取阳性重组质粒,经酶切和PCR鉴定,命名为pPIC9K-sE2.重组质粒pPIC9K-sE2经Sal Ⅰ酶切线性化,电穿孔导入P.Pastoris GS115基因进行整合,使外源基因sE2稳定地整合到P.Pastoris染色体中,G418筛选得到阳性高拷贝转化子GS115-pPIC9K-sE2.经甲醇诱导表达后,sE2融合蛋白获得了表达,表达产物经SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA分析,确定其表达的sE2融合蛋白相对分子质量大小为37 000,且具有天然蛋白的抗原特异性.免疫原性研究证明P.Pastoris表达的sE2蛋白能刺激动物产生特异抗体. 相似文献
17.
采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因，将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPlC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86，测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌Gs115，经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达，SDSPAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68ku重组Bm86蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32％以上，诱导96h目的蛋白的表达量为0．36mg／mL。 相似文献
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依据GenBank猪肠激酶催化亚基(EKL)基因的编码序列设计引物,通过RT-PCR方法从猪小肠黏膜组织中扩增EKL cDNA基因,利用SnaBⅠ和Not Ⅰ酶切位点,将该EKL片段插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K质粒中,并与载体中的α因子信号肽序列融合,构建EKL基因分泌型酵母重组质粒载体pPIC9K/EKL.重组质粒载体经Sal Ⅰ线性化后,以电转化的方法将其转移到组氨酸缺陷型的酵母宿主菌GS115中.然后利用以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选获得高拷贝猪EKL基因的重组酵母.经PCR检测证明EKL基因已整合到毕赤酵母的染色体中.重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,表达产物经SDS-PAGE及酶促活性检测,结果显示在酵母菌培养基中检测到相对分子质量为35 000的重组蛋白.经过对制备的胰蛋白酶原进行酶促水解检测,证明该重组蛋白具有激活胰蛋白酶原的活性,表明制备的重组猪EKL具有生物活性. 相似文献
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为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。 相似文献
20.
重组猪β防御素2在毕赤酵母中的表达及其鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
根据GenBank猪β防御素2(pBD-2)的氨基酸序列,参照酵母偏爱的密码子,设计无信号肽序列的pBD-2的基因编码序列,并由公司合成.将合成的基因通过SnaB Ⅰ和Not Ⅰ位点插入到酵母表达载体pPIC9K的α因子信号肽序列下游,构建成pBD-2基因的分泌表达载体pPIC9K/pBD-2.利用电穿孔法将经Sal Ⅰ线性化的pPIC9K/pBD-2质粒导入毕赤酵母GS115中,通过G418加压筛选得到His+Mut+表型的高拷贝转化子.经PCR检测证明pBD-2基因在毕赤酵母染色体上得到整合.阳性重组酵母经摇瓶发酵培养和甲醇诱导,用SDS-PAGE方法在发酵上清中检测到重组pBD-2的存在,说明构建重组酵母菌能够分泌性表达pBD-2.琼脂孔穴扩散法检测结果显示,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性. 相似文献