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1.
为克隆南阳牛BoLA-DRA基因,构建原核表达载体并研究该基因在大肠埃希菌中的表达。从南阳牛脾脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到BoLA-DRA基因,将其克隆至pGEM-Teasy克隆载体上,转化感受态细胞DH5α,经测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出重组表达质粒,经IPTG诱导表达。结果表明,本试验成功克隆了大小为917 bp的BoLA-DRA基因,重组质粒pGEX-4T-DRA在大肠埃希菌中以包涵体形式表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定大小为54.4 ku,与预期结果一致。为进一步研究该蛋白的功能及制备抗体奠定了基础。 相似文献
2.
从BL21(DE3)E．coli菌株中以PCR的方法扩增得到了与T7RNA多聚酶(T7RNApolymerase，T7pol)基因大小一致的DNA片断。将PCR产物纯化后直接克隆到pGEM—T载体中，经酶切鉴定和DNA序列分析表明克隆得到了正确的T7pol基因。将T7pol基因亚克隆入pET-28b( )中，构建得到原核表达质粒pET28T7。该质粒的BL21(DE3)pLysS转化菌在IPTG的诱导下可表达约98800的蛋白，这与T7pol的相对分子质量一致。将该质粒转化DH5α、JMl09、HBl01、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS等5种不同的宿主菌，仅有转化T7pol酶活性受到抑制的宿主菌BL21(DE3)pLysS才能得到转化子，而其余4种T7T7pol酶活性不受抑制的E．coli宿主菌不能得到转化子。pET28T7原核表达质粒这种仅能在T7pol酶活性受到抑制的宿主菌中才能存活的现象说明本试验所克隆的T7pol基因能正确表达出具有RNA转录酶活性的蛋白。 相似文献
3.
根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物，用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上，转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后，将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp，并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后，阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果，SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达，其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白，该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2020,(1):72-76
为了鉴定胞内劳森菌(Lawsonia intercellularis,LI)外膜蛋白LI0902在细菌感染中的作用,本试验以胞内劳森菌疫苗DNA为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,并成功构建诱饵表达载体pGBKT7-LI0902。将通过菌落PCR和测序验证的质粒转化酵母菌株Y2H Gold后,发现LI0902能在酵母细胞中正确表达,对酵母细胞无毒性,且无自激活活性。将含有pGBKT7-LI0902的酵母菌株Y2H Gold与猪肠上皮细胞系IPEC-1 cDNA文库菌株Y187进行杂交,筛选、验证、测序后得到3个与LI0902相互作用的宿主蛋白。本试验研究了胞内劳森菌与猪肠上皮细胞相互作用,为揭示增生性肠炎的致病机理提供了线索。 相似文献
5.
布鲁菌外膜蛋白Omp31原核表达及抗原性分析 总被引：1，自引：1，他引：0
克隆羊布鲁菌的外膜蛋白Omp31基因,在大肠埃希菌中表达、纯化,并对Omp31蛋白的抗原性进行分析。以羊布鲁菌的染色体DNA为模板,扩增Omp31基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠埃希菌ER2566(DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blot鉴定Omp31蛋白的抗原性。将Omp31克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中。将重组质粒转化于大肠埃希菌ER2566(DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 ku的融合蛋白。Western blot结果表明,表达的蛋白具有与布鲁菌外膜蛋白相同的抗原性。 相似文献
6.
以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板，PCR扩增其apfA特异性基因片段，PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化，经酶切及序列分析鉴定后，亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中，构建重组表达质粒pGEX-apfA，转化到感受态大肠杆菌DE3中，以IPTG进行诱导，进行SDS-PAGE电泳。结果表明，25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98％，所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000，与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。 相似文献
7.
重组和构建了新城疫病毒融合蛋白基因,并对该基因进行了鉴定。结果显示,将ＮＤＶ Ｆｘ基因片段经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,插入经ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９株。用氨苄青霉不平板法初步筛选克隆,双酶切法,核酸探针,ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定后,表明插入成功且阅读框架正确。 相似文献
8.
从重组克隆载体pMD18-T—egsmadC中扩增细粒棘球蚴egsmadC基因及其MH2编码序列,将其克隆入酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中,经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后,PEG／LiAe法转化酵母菌株,测定融合蛋白对酵母菌生长的影响和自激活活性。结果表明,egsmadC基因及其MH2编码序列表达的蛋白对酵母茵Y2HGold无毒性和自激活作用,可为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定基础。 相似文献
9.
参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。 相似文献
10.
采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。 相似文献
11.
羊泰勒虫主要表面蛋白P32基因的克隆及真核表达载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
提取羊泰勒虫裂殖子总RNA,用特异性引物扩增出其主要表面蛋白P32基因,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-T Easy 载体上,经PCR 和EcoRⅠ酶切鉴定均为阳性的重组质粒进行了测序和分析.随后将该基因从克隆载体上双酶切,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-MPSP-P32,转化大肠埃希菌JM109,经测序证实,基因序列完全正确. 相似文献
12.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因序列,设计合成一对引物,应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF7基因(N基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF7重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF7基因序列进行分析。结果表明,ORF7基因的原核表达载体构建成功。ORF7基因序列与美洲型的ORF7基因核苷酸同源性为92.8%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为65.3%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为92.0%～99.2%,与LV株的同源性为65.3%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。本研究为N蛋白的进一步研究和制备诊断性抗原奠定了基础。 相似文献
13.
采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌0157：H7021210的染色体DNA中扩增出既8A基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2800bp的基因片段。T—A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋）,经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET—eaeA。大肠埃希菌O157：H7eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及既8A基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。 相似文献
14.
利用同源序列克隆原理设计1对克隆引物,从绵羊结肠黏膜组织提取mRNA,通过RT-PCR获得CCL28基因,将PCR产物克隆、测序,并进行序列分析;再根据克隆的序列设计1对表达引物,用PCR法从重组克隆载体中扩增出含BamHⅠ/XhoⅠ酶切位点的CCL28片段,双酶切后亚克隆至pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达载体pGEX-CCL28,转化宿主菌E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE鉴定。克隆的绵羊CCL28基因包含完整的开放阅读框,克隆片段长444 bp,ORF为387 bp,编码129个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛该基因的同源性分别为76.4%、61.4%、84.3%和92.9%,推测的氨基酸序列与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为76%、63%、84%和93%,表达的融合蛋白分子量约为39 ku,并以包涵体形式存在。为下一步研究绵羊CCL28的生物学功能奠定基础。 相似文献
15.
为构建烟台黑猪SLA-2-YTH基因原核表达载体,本研究设计引物PCR扩增SLA-2-YTH胞外区,将其克隆至pMD 19-T Simple 载体,筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切后,进一步与表达载体pET-28a(+)连接,转化BL21（Rosseta）感受态细胞并进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,SLA-2-YTH胞外区亚克隆大小为834 bp,酶切鉴定证实其成功插入pET-28a（+）表达载体。SDS-PAGE结果显示,SLA-2-YTH基因导入宿主菌后成功表达,蛋白大小约31.0 ku,与预期结果相符,优化后蛋白相对表达量达25%以上。本研究成功构建了烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。 相似文献
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根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。 相似文献
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新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段. 相似文献
18.
貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中登录的犬瘟热病毒f基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的f基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后纯化回收,与经同样的酶酶切消化后并纯化回收的载体pPICZaA连接并转化E.coliDH5α,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子,阳性克隆菌经PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定表明目的基因插入位置、方向和阅读框正确。证明pPICZaA-f酵母表达载体构建成功。 相似文献
19.
根据GenBank上发表的羊痘病毒(CPV)P32基因序列,设计并合成一对引物,PCR扩增出837bp基因片段并克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定并测序。将P32基因定向克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用镍离子亲和树脂在变性条件下对蛋白进行纯化,Western blot证明该重组蛋白具有良好的反应原性。 相似文献
20.
为探讨微小隐孢子虫的入侵机制,克隆、表达了微小隐孢子虫LCCL结构域基因。从已构建的微小隐孢子虫cDNA文库中,采用PCR随机扩增LCCL结构域基因。与Pmd-18-T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析。用基因重组技术将LCCL结构域基因克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建LCCL结构域基因的重组原核表达载体pGEX-4T-1-LCCL。重组质粒经酶切、测序鉴定后转入大肠埃希菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。最终得到了在大肠埃希菌中高效表达的重组蛋白,分子质量大小约为37ku,并且具有反应原性,为进一步研究微小隐孢子虫的入侵机制奠定了基础。 相似文献