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猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA基因特异片段的克隆和表达 总被引：3，自引：1，他引：3
以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建成重组表达质粒pGEX-apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,25-4株apxIVA gene与基因库中标准7型apxIVA gene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符.apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础. 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25＿4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18＿T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX＿6P＿1中,构建成重组表达质粒pGEX＿apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS＿PAGE电泳。结果表明,25＿4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxⅡCA基因的克隆和基因缺失 总被引：2，自引：0，他引：2
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25-4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18-ApxIICA,将pMD18-ApxIICA转化到E.coli JM83中并测序.序列分析表明血清型7型25-4株ApxII CA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上.利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18-ApxII△/CA. 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅢA基因的克隆和表达 总被引：4，自引：3，他引：4
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型参考株基因组DNA为模板，PCR方法扩增出apx ，ⅢA基因3．1kb的片段，扩增产物克隆于pMD18-T中，重组质粒经酶切鉴定后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中不同血清型胸膜肺炎放线杆菌apx11A基因进行比较，结果显示核苷酸同源性均在96％以上。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的BamHⅠ／Sal Ⅰ位点，成功构建了重组表达载体pGEX—apx ⅢA，转化大肠杆菌BL-21（DE3）中并获得表达。SDS—PAGE结果显示，表达的融合蛋白分子量约为140Ku，与预测相符，Western blot证明该融合蛋白具有免疫学活性。该融合蛋白的成功表达为猪传染性胸膜肺炎亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板，PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5’末端保守区基因片段(OMPc)，酶切及核苷酸序列分析鉴定后，与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接，构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc，转入大肠杆菌B121中，以IPTG进行诱导，SDS-PAGE电泳分析发现，转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34kD，与实际预测相符，命名为GST-OMPc。GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测。结果表明：纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应。OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础。 相似文献
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猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型7型25＿4株ApxIICA基因用特异性引物进行PCR扩增并克隆到T载体上,构建重组质粒pMD18＿ApxIICA,将pMD18＿ApxIICA转化到E.coliJM83中并测序。序列分析表明血清型7型25＿4株ApxIICA与其它血清型(5型和9型)核苷酸序列同源性达98%以上,氨基酸序列同源性达90%以上。利用ApxIIC基因内部单一的SpeI位点,设计特异性的引物,利用PCR技术在ApxIIC基因内部缺失165bp的核苷酸片段,PCR产物再用SpeI进行酶切,并体外连接构建得到含有ApxIIC缺失基因的重组质粒pMD18＿ApxII△CA。 相似文献
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以猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型25-4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增外膜蛋白(OMP)5′末端保守区基因片段(OMPc),酶切及核苷酸序列分析鉴定后,与原核表达载体质粒pGEX-6P-1进行连接,构建成重组表达载体pGEX-OM-Pc,转入大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳分析发现,转化了重组质粒的菌株所表达的融合蛋白相对分子量为34 kD,与实际预测相符,命名为GST-OMPc.GST亲和层析柱进行纯化,ELISA方法对纯化蛋白进行检测.结果表明:纯化蛋白GST-OMPc能够与兔抗猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型的阳性血清反应.OMPc蛋白的成功表达为其功能的研究打下基础. 相似文献
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猪胸膜肺炎放线杆菌新疆株的分离鉴定及ApxⅣA基因的克隆与序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
从新疆北疆4个规模化猪场的20份发病猪病料中分离到1株细菌。经形态染色镜检、培养特性、生化特性和部分生物学特性试验鉴定为猪胸膜肺炎放线杆菌。根据猪胸膜肺炎放线杆菌ⅣA毒素基因特异性引物进行PCR扩增,得到1条与预期大小一致的2427bp的条带,将PCR产物纯化后克隆至pMD19-T载体上并测序。结果表明,该片段的碱基序列与GenBank中参考序列的同源性为98%,并与三株标准株比较,同源性分别为98.23%、99.46%和98.06%。 相似文献
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结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10基因的克隆、鉴定及其原核表达 总被引：3，自引：0，他引：3
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础 相似文献
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根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802～4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。 相似文献
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鹅细小病毒VP3基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达 总被引：2，自引：0，他引：2
根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的Vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。 相似文献
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ABSTRACT: Porcine pleuropneumonia caused by Actinobacillus pleuropneumoniae accounts for serious economic losses in the pig farming industry worldwide. We examined here the immunogenicity and protective efficacy of the recombinant type IV fimbrial subunit protein ApfA as a single antigen vaccine against pleuropneumonia, or as a component of a multi-antigen preparation comprising five other recombinant antigens derived from key virulence factors of A. pleuropneumoniae (ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA, ApxIVA and TbpB). Immunization of pigs with recombinant ApfA alone induced high levels of specific serum antibodies and provided partial protection against challenge with the heterologous A. pleuropneumoniae serotype 9 strain. This protection was higher than that engendered by vaccination with rApxIVA or rTbpB alone and similar to that observed after immunization with the tri-antigen combination of rApxIA, rApxIIA and rApxIIIA. In addition, rApfA improved the vaccination potential of the penta-antigen mixture of rApxIA, rApxIIA, rApxIIIA, rApxIVA and rTbpB proteins, where the hexa-antigen vaccine containing rApfA conferred a high level of protection on pigs against the disease. Moreover, when rApfA was used for vaccination alone or in combination with other antigens, such immunization reduced the number of pigs colonized with the challenge strain. These results indicate that ApfA could be a valuable component of an efficient subunit vaccine for the prevention of porcine pleuropneumonia. 相似文献
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从小反刍兽疫病毒全长cDNA中对血凝素蛋白H基因进行特异扩增,回收PCR产物分别连接于T载体酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBacHT,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒。重组质粒转染sf9细胞后连续传3～4代,分别收获细胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western blot对重组H蛋白的检测,用抗His蛋白单抗在细胞中检测到H标签蛋白,单抗在细胞及上清中检测到大小为46 ku的融合蛋白。 相似文献
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以pgsBCA质粒为模板对已知的pgsA进行PCR扩增,得到长度为1116bp的片段.将获得的PgsA基因连接到pQE-30表达载体,转化大肠埃希茵后用IPTG诱导其表达,经SDS-PAGE和WeSternblot分析,均可见约42 ku目的蛋白带.通过Ni-NTA agarose纯化,荻得较高纯度的重组蛋白,经基因定量仪测定其浓度可达1.5 mg/mL,以其免疫新西兰兔获得免疫血清,Western blot分析证实,该重组蛋白具有良好的反应原性,用间接ELISA检测抗体效价可高达1:12800.结果表明,成功获得了pgsA的多克隆抗体. 相似文献
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从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株. 相似文献