共查询到20条相似文献，搜索用时 187 毫秒
1.
通过原核表达的方式获得能在多种病原菌表面表达的烯醇化酶(Enolase,Eno),探索Eno在脑膜炎致病过程中的作用。根据GenBank上公布的基因序列设计Eno特异性引物,通过PCR技术扩增2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的Eno基因序列,克隆到pMD18-T载体,进一步亚克隆到原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a-Eno,转化入大肠杆菌BL21Codon Plus(DE3)感受态中诱导表达,经镍离子螯合柱纯化后,检测其对体外血脑屏障模型通透性的影响。结果显示,经1mmol/L IPTG诱导5h为最佳诱导条件,目的蛋白约54 000,与预期蛋白大小相符合;纯化的蛋白Western blotting分析表明,其具有较好的免疫原性;Eno可致体外血脑屏障模型通透性增加。结果表明,Eno作为SS2潜在的毒力因子在SS2引起脑膜炎的致病过程中起到重要的作用。 相似文献
2.
狂犬病病毒BD-06株基质蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究旨在获得抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为进一步研究M蛋白功能提供材料。本试验以狂犬病病毒BD06毒株为模板克隆M基因序列,将其克隆至原核表达载体pET28a;经酶切和测序鉴定,M蛋白基因序列已正确插入表达载体pET28a;以表达载体pET28a-M转化E.coli Rosetta株,并以0.5 mmol/L IPTG诱导,结果表达出27 ku左右的M蛋白;将诱导表达的蛋白质回收纯化,以纯化的M蛋白多次免疫兔子制备多克隆抗体;Western blotting分析和间接免疫荧光分析结果表明,制得的抗体与病毒能够反应,运用制得的多克隆抗体定位了基质蛋白在感染狂犬病病毒的BHK-21细胞中的位置。结果表明成功制得了抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为研究狂犬病病毒M蛋白功能奠定了基础。 相似文献
3.
将pGEM—TM质粒上的土耳其斯坦东毕吸虫原肌球蛋白（TM）基因片段亚克隆至原核表达载体pET28a（＋），重组的pET28-TM在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中经1mmol／LIPTG诱导表达出-37．5ku的融合蛋白。该蛋白经Ni—NTA亲和层析柱纯化，SDS—PAGE检测，出现与目的蛋白大小一致的单一条带。Western-blotting检测结果表明，纯化的蛋白可被自然感染东毕吸虫的山羊血清识别，这为进一步研究东毕吸虫基因工程疫苗奠定了基础。 相似文献
4.
本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b（Omp2b）基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21（DE3）菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041 bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38 ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。 相似文献
5.
根据GenBank已发表的猪Sar1b基因序列（GenBank登录号：AY819557）设计1对引物,以猪肝脏组织总RNA的反转录产物为扩增模板,用RT-PCR方法扩增出猪Sar1b基因cDNA全长编码区,经过EcoRI-SalI双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-Sar1b重组原核表达载体。将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol/LITPG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为26 ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。猪Sar1b基因的克隆和表达研究,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
6.
以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切已构建的pGEM-T-85A和pET28a（＋），并将纯化的Ag85A基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达质粒pET28a-85A。将pET28a-85A转化至感受态E．coli BL21（DE3）中，经IPTG诱导和SDS-PAGE分析，可见约32ku的外源蛋白带。Western-blotting分析表明，该蛋白具有牛分枝杆菌的抗原性。 相似文献
7.
8.
以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板．根据已发表的Ag85B成熟蛋白基因的核苷酸序列设计合成特异性引物进行PCR扩增．获得约860bp的DNA片段。通过T-A克隆技术．将PCR产物克隆至pGEM-T载体中．成功地构建出克隆载体pGEM-T-85B。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-85B和pET28a（＋）．并将纯化的Ag85B基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达载体pET28a-85B。将pET28a-85B转化至感受态E.coli BL21（DE3）中．经IPTG诱导和SDS-PAGE分析．可见约30000的外源蛋白带。Western blot分析发现，该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性．从而为进一步研究Ag85B的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。 相似文献
9.
为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。 相似文献
10.
根据GenBank已发表的红色原鸡FOXL2基因序列(登录号NM_001012612.1)设计引物,以来航鸡全血为模板,PCR扩增出其基因全长编码区,经BamHⅠ-HindⅢ双酶切后定向克隆于pET28a原核表达载体,获得pET28a-FOXL2重组原核表达载体.将携带有重组原核表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)通过0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大小大约为37 000,与预期表达蛋白大小一致.Western blotting检测显示该蛋白为His融合蛋白,表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白.为进一步探索该基因的生物学功能奠定了基础. 相似文献
11.
烯醇化酶参与支原体糖酵解、细胞黏附及免疫调节等多种生命活动,对其开展功能研究有助于了解鸡毒支原体黏附及感染机制。本研究通过重叠PCR克隆获得鸡毒支原体烯醇化酶,经原核表达获得可溶性融合蛋白rMGEno,将纯化产物免疫BALB/c小鼠后制备获得特异性多抗。通过Western blot和ELISA检测发现,烯醇化酶在鸡毒支原体不同强弱毒株中高度保守,表达产量高,在鸡毒支原体参试各毒株的细胞膜中均有分布。这一表达产物的成功制备为深入研究鸡毒支原体烯醇化酶的生物学功能奠定了基础。 相似文献
12.
以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。 相似文献
13.
采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含IL-15基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下IL-15基因的表达情况,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET28c（＋）-IL-15含有IL-15基因且阅读框架正确,以IPTG诱导IL-15基因表达的优化条件是：培养基pH7．0,培养温度37℃,IPTG浓度1．0mmol／L,茵体生长密度0D600达到1．0时加入IPTG,诱导时间3h,IL-15蛋白表达量为28％,为IL-15的生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 相似文献
14.
对2005年四川资阳脑膜炎病例猪链球菌2型分离株ZYH33溶血素编码蛋白中包含多个抗原表位的第230～593氨基酸残基区域的基因片段进行扩增并克隆.基因片段经酶切处理后插入表达载体pQE-30的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ位点之阃,构建融合表达质粒.转化宿主菌TG1经IPTG诱导后融合基因得到了表达,用猪链球菌2型菌体抗血清对表达的融合蛋白进行免疫印迹试验,分析融合蛋白的免疫反应性.试验结果提示该溶血素蛋白第230～593氨基酸残基区域可作为猪链球菌的诊断抗原,为基因工程疫苗的研制奠定基础. 相似文献
15.
人γ干扰素的高效表达 总被引：1，自引：1，他引：0
采用限制性核酸内切酶酶切鉴定含hIFN-γ基因的重组质粒,SDS-PAGE检测不同条件下hIFN-γ基因的表达情况,用Western blot和亲和层析对表达产物进行鉴定和纯化,并对表达条件进行优化。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实重组质粒pET32a（＋）-hIFN-γ含有hIFN-γ基因且阅读框架正确,以IPTG诱导hIFN-γ基因表达的优化条件是：培养基pH7.0,培养温度37℃,IPTG浓度0.8 mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时hIFN-γ蛋白表达量为52%。从而实现了hIFN-γ基因的高效表达并优化了其表达工艺。从而为hIFN-γ的生物活性和生产工艺研究提供了可靠的试验数据。 相似文献
16.
根据GenBank中已发表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）HuN4株全基因组序列,设计合成一对引物,对PRRSV HuN4株非结构蛋白Nsp4（Nonstructural protein 4基因进行RT-PCR扩增,克隆到原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体pET30a-Nsp4,经酶切测序鉴定。将pET30a-Nsp4转化表达菌株BL21（DE3）,诱导可表达分子量约为27kDa重组蛋白。Westernblot显示其具有较好的反应原性,经镍离子亲和层析（Ni-NTA）纯化获得了高纯度的可溶性重组蛋白。将纯化的Nsp4蛋白免疫BALB／c小鼠,抗血清ELISA效价达1：16000,Western blot和IFA表明,所制备的抗血清能够特异性识别PRRSV自身表达的Nsp4蛋白。本研究获得了可溶性的PRRSV Nsp4蛋白,制备了Nsp4特异性多抗血清,为进一步研究Nsp4蛋白的亚细胞定位及功能奠定了基础。 相似文献
17.
将V13KL编码基因片段克隆到原核表达载体pET30b（＋），并在目的蛋白N端设计肠激酶酶切位点，构建出pET30b（＋）-VK13L重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），优化诱导条件，使得抗菌肽得到了高效表达。经Tricine-SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，目的蛋白的相对分子质量与预期一致。结果表明，V13KL基因成功克隆并且获得表达，在诱导体系中加入1mmol／LIPTG诱导6h便可检测到蛋白表达。 相似文献
18.
利用含有白喉毒素N端序列的基因作上游引物、含有αMSH全序列作下游引物,以pET28a/DAB389-EGF为模板,PCR扩增DAB389-αMSH基因片段,用限制性内切酶EcoR I和NcoI酶切,并插入原核表达载体pET28a的相应位点,构建了重组表达载体pET28a/DAB389-αMSH,在大肠杆菌中表达重组融合蛋白DAB389-αMSH,转化菌经1 mmol/L IPTG、30℃诱导5 h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定表达的重组毒素。结果表明扩增的片段与理论值一致,重组质粒的DNA序列分析正确;SDS-PAGE表明重组毒素相对分子量为43.76 KD,且表达量达菌体总蛋白量的31.6%。Western blot分析显示,重组毒素能特异性地与抗白喉抗体结合,表明已成功构建表达了重组DAB389-αMSH的工程菌株,并获得表达蛋白。 相似文献
19.
UL36USP是马立克病毒UL36基因编码的蛋白UL36上具有去泛素化酶活性的N-端部分片段（UL36USP）,本试验以提取MDCC-MSB1细胞的基因组为模板通过PCR获得目的基因,将UL36USP基因克隆入pMD18T载体,测序正确并酶切鉴定后,将目的基因亚克隆到pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-UL36USP。将重组质粒转化BL21（DE3）E.coli中,IPTG诱导表达并使用Ni-NTA Agarose亲和层析进行纯化得到目的蛋白。应用纯化后的UL36USP免疫獭兔制备多克隆抗体。使用昆虫细胞表达系统表达的UL36片段检测多克隆抗体的特异性。结果显示成功制备特异性的UL36USP抗体。 相似文献
20.
目前广泛应用的各类胶原及胶原蛋白多为人工提取的方法获得,为了得到高纯度原核表达的胶原蛋白,本研究构建了血吸虫V型胶原蛋白（Schistosoma japonicum type V collagen,Sj Col V）（a1）基因AY815998.1的原核表达质粒,并对其进行了原核表达。结果表明SjColV（a1）蛋白能在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中高效表达,但原核表达的融合蛋白不够稳定,且存在形式多样。本文就其表达情况进行了分析,并纯化得到原核表达的全长rSjColV（a1）,用V型胶原蛋白的单抗对其进行鉴定,同时分析其在？80℃保存的稳定性,研究结果为SjColV（a1）的深入研究和利用提供了一定的理论依据。 相似文献