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1.
为建立鸽白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）基因实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上公布的鸽IL-8基因序列,在保守区域设计1对特异性引物,以鸽子淋巴细胞提取的核酸为模板扩增鸽IL-8基因部分片段并克隆到pMD18-T载体上。提取重组质粒通过系列制备标准品,建立鸽IL-8基因SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,实时荧光定量PCR熔解曲线呈单一熔解峰,试验线性相关系数为1.0,IL-8基因的扩增效率为103%。敏感性结果显示最低可检测到16个拷贝数;用该方法检测其他鸽白细胞介素细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）和双蒸水的结果均为阴性。批间、批内变异系数均≤1.52%。因此,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸽IL-8 mRNA的检测,为病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。 相似文献
2.
为对鸡髓样分化因子88(MyD88)、包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白(TRIF)和包含Toll/IL-1的接头蛋白(TIRAP)基因的进行定量检测,本研究参考鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因序列,设计并合成特异性引物,以β-actin为内参基因,建立检测对应基因的实时荧光定量PCR方法.结果表明,4个基因的扩增效率为96.7%～102%,相关系数均在0.997以上;特异性强,扩增产物均形成单一的特异性熔解峰;敏感性高,可以检测到对应基因达10-13g/mL;重复性好,变异系数均在1.5%以下.本研究所建立的荧光定量PCR方法可用于鸡MyD88、TRIF和TIRAP基因表达研究. 相似文献
3.
鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染,该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大,复制非必需区多,可容纳多个外源基因的插入,被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前,尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点,明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528bp连续核苷酸缺失,设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物,建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明,建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL~(-1)时有良好的线性扩增,其标准曲线方程Y轴截距为34.95,斜率为-3.218,扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%;敏感性强,最低检测限为52.5拷贝·μL~(-1);特异性好,对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析,仅出现1个单特异峰值[Tm=(90.62±0.28)℃],无引物二聚体,对其他鸭源传染病病原(如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法,为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。 相似文献
4.
鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 相似文献
5.
试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。 相似文献
6.
《中国兽医杂志》2019,(1)
根据GenBank羊炎性细胞因子(IL-1β和IL-8)和Mx1保守序列,设计特异性引物,利用SYBR Green I染料法建立实时荧光定量检测方法。将羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子基因保守区域克隆到pMD18-T载体,构建标准质粒。分别以标准质粒为模板建立荧光定量PCR反应的标准曲线、熔解曲线。结果表明,羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R~2均大于0.990,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰。应用所建立的方法对山羊痘病毒AV41感染山羊外周血淋巴细胞中IL-1β、IL-8和Mx1 mRNA表达水平进行检测,山羊痘病毒AV41可以刺激机体产生较高的炎性细胞因子。建立的羊IL-1β、IL-8和Mx1细胞因子荧光定量检测方法,可以为山羊痘病毒感染后分子免疫机制研究奠定基础。 相似文献
7.
为建立鸭腺病毒3型(duck adenovirus 3,DAdV-3)一种基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR诊断方法,本试验根据DAdV-3基因组序列中相对保守的Fiber-2基因,通过普通PCR扩增,构建pMD19-Fiber2重组质粒为阳性标准品,在此基础上设计合成特异性引物进行实时荧光定量PCR方法的建立,对其灵敏性、特异性和重复性进行评价,并初步应用于临床样本检测。结果显示,针对DAdV-3的Fiber-2基因建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法线性关系良好,相关系数0.998 9;检测DAdV-3的灵敏度为3.6×102 copies/μL,敏感性比普通PCR检测方法高100倍;该方法对鸭腺病毒1型、鸭疫里默杆菌等其他常见病原均无交叉扩增反应,批内、批间变异系数均小于5%;临床样本检测与普通PCR符合率100%。以上结果表明,所建方法特异性强、敏感性高且重复性好,适用于临床检测,该方法可为DAdV-3的临床诊断、流行病学调查以及防控提供技术支持。 相似文献
8.
采用荧光SYBR Green I建立小鼠细胞因子mRNA实时定量PCR的检测方法;并利用建立的实时定量PCR的检测方法时感染H5N1禽流感病毒的BALB/c小鼠不同时间采集的肺脏组织中几种重要致炎细胞因子及趋化因子mRNA表达水平进行了检测.对HSN1禽流感病毒感染的BALB/c小鼠肺脏细胞因子的检测具有高度的特异性,检测的灵敏度为10~1～10~2拷贝数.H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠后,小鼠肺脏中IL-1β、IL-6、TNFα、MIG、IP-10、RANTES、MIF和HMGB1细胞因子mRNA表达水平与时照组小鼠相比均有明显差异.建立的实时定量PCR能在基因转录水平敏感和特异地反应细胞因子的表达水平,该技术在基础和临床免疫研究中,具有良好的应用价值. 相似文献
9.
为建立定量检测猪Janus激酶(JAK)和信号转导和转录激活因子(STAT) mRNA的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究针对猪JAK-1,JAK-2,STAT-1、STAT-2及管家基因β-actin的序列设计了特异性的引物和探针,分别构建了各自的阳性重组质粒,建立了TaqMan荧光定量PCR方法.结果表明:所建立的检测方法荧光定量PCR扩增均无非特异性产物的产生;检测下限均达1.0×101 copies/μL;批内及批间变异系数均小于2％.利用该方法对猪细小病毒(PPV)感染ST细胞48 h后JAK-1、JAK-2、STAT-1和STAT-2 mRNA的转录水平进行了检测,结果表明:JAK-1和JAK-2转录水平显著上调,STAT-1和STAT-2转录水平呈现下调趋势,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,适于猪细胞传导因子JAK和STAT的定量检测. 相似文献
10.
为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒（D-GPV）的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。 相似文献
11.
根据GenBank中鸭IFN-α基因(GenBank登录号:JF894229)序列设计并合成引物,并以鸭β-actin基因(GenBank登录号:GU564232)为内参,采用SYBR Green I染料法,建立检测鸭IFN-αmRNA的实时荧光定量Real-time PCR方法(RT-PCR)。将IFN-α和β-actin基因分别克隆至pMD18-T载体上,鉴定出阳性重组质粒为标准品(p-IFN-α和p-β-actin),分别建立番鸭IFN-α和β-actin实时荧光定量RT-PCR方法。结果表明,Ct值在13.27~27.54与11.86~25.32范围内呈现良好的线性关系,相关系数均大于0.99(r>0.99),扩增产物的熔解曲线分析均各自只出现1个特异性单峰,无引物二聚体,Tm值分别为(93.6±0.26)℃和(85.3±0.15)℃,最低检测限分别为9.37×102copies/μL和3.71×101copies/μL,检测周期从样品的处理到荧光定量PCR结束仅需4 h左右。本研究建立的鸭IFN-α基因实时荧光定量PCR灵敏度高、特异性强、检测周期短,为番鸭IFN-αmRNA的定量分析奠定了基础。 相似文献
12.
《中国动物传染病学报》2015,(3)
根据鸭Toll样受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)的基因序列保守区设计特异性引物,以鸭β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立了一种检测鸭TLR3 mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法。该方法的标准曲线在1×102~1×108copies/μL范围内,具有良好的线性关系,相关系数和扩增效率均在0.9以上。熔解曲线显示,PCR产物为单峰,具有高度扩增特异性。重复性结果表明,该方法组内、组间变异系数均小于3%,最低检测浓度达100 copies/μL。利用该方法检测了TLR3在鸭组织器官中的表达和分布情况,结果表明,TLR3在鸭子的各种组织或器官中均有分布,其中以气管的表达水平最高,而在脾脏的表达水平最低。该检测方法的成功建立为研究TLR3在鸭天然免疫过程中的生物学功能提供了良好的技术手段。 相似文献
13.
为建立同时检测鸭甲型肝炎病毒3型（DHAV-3）和鸭圆环病毒（DuCV）的双重荧光定量PCR方法，试验根据NCBI中收录的DHAV-3 VP1和DuCV cap基因序列，分别设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针，建立了同时检测DHAV-3和DuCV的双重荧光定量PCR，对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估，并采用该方法对临床样品进行检测。结果显示：建立的方法不与其他常见鸭病原发生交叉反应，对DHAV-3和DuCV的检测灵敏度分别为3.8 copies/μL和7.3 copies/μL，批内和批间变异系数均小于2%，从65份临床样品中分别检出DHAV-3和DuCV阳性样品11份和28份，与现有地方标准符合率分别为95.4%和90.8%。研究表明，建立的双重荧光定量PCR特异性强、敏感性高、重复性好，可用于DHAV-3和DuCV的快速检测。 相似文献
14.
《中国家禽》2017,(20)
研究旨在建立一种适用于鸭坦布苏病毒检测的荧光定量Taq Man RT-PCR技术。以JXSP株RNA为模板,建立检测鸭坦布苏病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。制备含有上述目的片段的RNA作为标准品,10倍比稀释后建立标准曲线,测定敏感性。同时采用标准品对该方法的批内和批间重复性进行检测,并与本实验室所保存的多种病毒进行特异性检测。结果:建立的荧光定量Taq Man RT-PCR方法能在鸭坦布苏病毒JXSP株RNA样本中检出荧光信号。最低检出量为2.06×10~1拷贝/反应;线性范围达9个数量级。该方法重复性良好,批内变异系数不足0.4%;批间变异系数不足2.2%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,经体外感染细胞培养物及临床样品检测证实,该方法可实时反映病毒液中的病毒含量,可在获得样品后3 h以内得到检测结果,可用于临床样品中鸭坦布苏病毒的快速检测。 相似文献
15.
为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R2值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%～0.43%,组间变异系数为0.67%～0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。 相似文献
16.
《中国动物传染病学报》2016,(1)
该研究旨在建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的荧光定量PCR诊断方法。本实验以感染新型鸭呼肠孤病毒的鸭组织RNA提取物为模板,根据Gen Bank数据库中呼肠孤病毒S1基因全序列,设计合成了一对特异性引物,PCR扩增基因片段,将其克隆至p ET-30a载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green II荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段与预期目的片段相符,所建立的SYBR Green II荧光定量PCR检测S1的反应在101~108 copies/u L之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10 copies/μL,而H5型禽流感病毒、H9型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、C型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鹅细小病毒、鸭瘟病毒等病毒的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。本研究成功建立了SYBR Green II荧光定量PCR检测新型鸭呼肠孤病毒的方法,为新型鸭呼肠孤病毒致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。 相似文献
17.
《中国兽医学报》2014,(6):883-888
本研究旨在建立鸡白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和白细胞介素18(IL-18)基因实时荧光定量PCR(Realtime FQ-PCR)检测方法。应用RT-PCR方法扩增鸡外周血淋巴白细胞(peripheral blood leukocytes,PBLs)的IL-6和IL-18基因片断,分别克隆至pGM-T载体上,将浓度梯度的IL-6和IL-18基因的重组质粒DNA进行实时荧光定量PCR,并建立相应的标准曲线。经PCR、双酶切和测序分析显示,成功地构建了重组克隆质粒pGM-T-IL-6和pGM-T-IL-18。标准曲线分析显示,IL-6和IL-18基因标准曲线的Ct值与其标准品浓度的对数值之间有良好的线性关系,IL-6和IL-18检测的灵敏度均达到10拷贝/μL。为下一步应用实时荧光定量PCR技术检测IL-6和IL-18基因的转录水平奠定了基础。 相似文献
18.
《中国预防兽医学报》2021,(5)
为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。 相似文献
19.
为建立一种牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus, BRSV)快速简便的检测方法,本研究基于BRSV M基因保守区序列,设计特异性引物及探针,通过优化反应条件,建立用于BRSV检测的一步法实时荧光定量PCR,并验证了该方法的敏感性、特异性和重复性;同时利用建立的检测方法对采集的临床样本进行检测。结果表明：本研究所建立的BRSV荧光定量检测方法,其特异性好,仅对BRSV存在特异性扩增;敏感性高,最低可达10 copies/μL;稳定性好,组内变异系数和组间变异系数小。使用所建立的BRSV一步法实时荧光定量PCR对宁夏地区94份临床样品进行检测,阳性率为5.3%(5/94)。上述结果表明,本研究建立的检测方法可为BRSV的快速诊断提供有力的技术支持。 相似文献
20.
新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较.结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰.对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号.对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍.组内和组间变异系数均小于2％,重复性好.该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法. 相似文献