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1.
猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是世界各地重要猪病毒性病原之一,每年给养猪业造成重大损失。本试验建立了应用TaqMan-LNA的荧光定量RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)2种PRRSV检测方法。结果表明荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测下限分别为102和101 拷贝数/μL,都具有良好的特异性。临床样本检测结果同样表明2种方法都具有良好的特异性和灵敏度。本试验所建立的TaqMan-LNA荧光定量RT-PCR和RT-LAMP可有效的应用于PRRSV的检测。 相似文献
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针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因设计了2对特异性引物,建立了快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的环介导等温扩增(RT-LAMP)方法,并进行了酶切鉴定以及特异性、灵敏性和临床试验确定。酶切鉴定试验结果与RT-LAMP结果完全符合;特异性试验结果表明本研究所建立的RT-LAMP检测方法只针对猪繁殖与呼吸综合征病毒;灵敏度试验结果显示RT-LAMP是RT-PCR方法的100倍;临床试验中RT-LAMP方法的检出率与病毒分离的符合率为100%。本检测方法操作简单,不需要复杂的仪器,是适合基层和现场检测而无需送至诊断实验室的快速灵敏实用的分子生物学检测方法。 相似文献
3.
根椐GenBank中已发表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)2种病毒基因序列,分别设计2对引物。在建立2种病毒单项一步法RT-PCR检测方法的基础上,优化一步法二重RT-PCR反应条件,建立了2种病毒的一步法二重RT-PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV核酸模板进行一步法二重RT-PCR扩增,结果可同时扩增美洲型PRRSV的265 bp和欧洲型PRRSV的451 bp的特异性片段,而对其他4种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检出10 Pg的美洲型PRRSV和10 pg的欧洲型PRRSV模板。通过对175份临床病料检测,将建立的一步法二重RT-PCR技术和单项一步法RT-PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法二重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对美洲型和欧洲型PRRSV的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
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根椐GenBank 中已发表的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)2 种病毒基因序列,分别设计2 对引物。在建立2 种病毒单项一步法RT-PCR 检测方法的基础上,优化一步法二重RT-PCR 反应条件,建立了2 种病毒的一步法二重RT-PCR 检测方法,用这2 对引物对同一样品中的美洲型PRRSV、欧洲型PRRSV 核酸模板进行一步法二重RT-PCR 扩增,结果可同时扩增美洲型PRRSV 的265 bp 和欧洲型PRRSV 的451 bp 的特异性片段,而对其他4 种猪病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该方法能检出10 pg 的美洲型PRRSV 和10 pg 的欧洲型PRRSV 模板。通过对175 份临床病料检测,将建立的一步法二重RT-PCR 技术和单项一步法RT-PCR 方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法二重RT-PCR 检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对美洲型和欧洲型PRRSV 的同时检测和鉴别诊断。 相似文献
5.
为建立一种快速诊断美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(NA-PRRSV)的可视化检测方法,根据GenBank已发表的美洲型PRRSV经典病毒株JXA1序列,运用在线生物软件设计合成并筛选出1组引物,通过反应体系优化,建立了NA-PRRSV RT-LAMP可视化快速检测方法,并验证了该方法的特异性、敏感性,同时开展了初步临床应用。结果显示:该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可检测病毒RNA模板的最低浓度为10 copies/μL;应用该方法检测30份临床样品,结果与实时荧光RT-PCR方法符合率为100%,进一步证实了该方法的可行性。结果表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、可视等优点,适用于NA-PRRSV的现场快速检测。本研究为NA-PRRSV的快速、准确鉴别提供了有效手段。 相似文献
6.
设计两套反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)引物,建立了检测美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株的RT-LAMP方法。采用RT-LAMP方法与实时荧光RT-PCR方法检测58份病料,结果一致,但RT-LAMP方法的灵敏度大约高出10倍。RT-LAMP方法特异性良好,检测猪瘟、伪狂犬病和细小病毒等均未出现交叉反应。结果表明,建立的美洲型猪蓝耳病病毒及其高致病性变异株RT-LAMP检测方法具有特异、灵敏、高效和简便的特点,在我国猪蓝耳病快速检测领域将有广阔的应用前景。 相似文献
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根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株的基因序列,设计U1和U6两套PCR引物和荧光探针,建立了扩增U1和U6基因的荧光RT-PCR用于检测美洲型PRRSV。用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA、RNA进行扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟（HCV）、猪伪狂犬（PRV）等7种病毒进行特异性检测。结果显示建立的扩增U1和U6基因的荧光RT-PCR可用于检测PRRSV,其灵敏度为10个拷贝的质粒DNA,而与HCV等非PRRSV无交叉反应。本研究所建立的荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于PRRSV样品的检测。 相似文献
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为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID50/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。 相似文献
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根据Genbank上已报道的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列设计了2对LAMP引物(P-F3/P-B3、P-FIP/P-BIP),通过反转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)反应条件的优化,建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RT-LAMP检测方法,并通过酶切的方法对阳性结果进行了验证。本方法最低可以检测到反应体系内1pg的PRRSV的RNA,表明本方法具有较高的检测灵敏度;通过在反应中加入SYBR-Green I荧光染料后可以方便地用肉眼对试验结果进行可视化判定。所以,本研究建立的PRRSV的RT-LAMP检测方法能够满足基层临床PRRSV病原的快速检测要求。 相似文献
12.
为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。 相似文献
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为了建立鉴别欧洲型和美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的荧光定量RT-PCR方法,根据欧洲型和美洲型PRRSV的M基因保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够鉴别欧洲型和美洲型PRRSV的双重双色荧光定量RT-PCR方法。该方法的重复试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为1.30%和1.96%;灵敏性及特异性试验表明其检测下限为1×101copies/μL,而且与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该检测方法的建立为不同型别的PRRSV快速诊断提供了有效手段,能够应用于临床样品检测。 相似文献
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《畜牧与兽医》2015,(5):26-30
参考Gen Bank中猪乙型脑炎病毒(JEV)Ⅰ型和Ⅲ型毒株的E基因序列,通过比对分析,选取8个保守区域设计了6条引物,经条件优化及临床样品验证,本研究建立了能同时检测JEVⅠ型和Ⅲ型毒株E基因的RT-LAMP方法。该方法的最低检测灵敏限度为15 copies,具有较好的特异性,对猪常见病原如猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪细小病毒(PPV)和伪狂犬病病毒(PRV)等均没有特异性扩增。与RT-PCR检测方法相比,其灵敏性高10倍。用本研究建立的RT-LAMP方法检测来自屠宰场的1 500份猪血清,阳性检出率为0.4%,与RT-PCR吻合率达100%,表明本试验建立的RT-LAMP方法适用于Ⅰ、Ⅲ基因型JEV的快速、批量筛检,为JEV感染的流行病学调查提供了必要的技术手段。 相似文献
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根据GenBank中已登录的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Nsp7基因中的保守区域设计合成了1对特异性引物,通过反应条件的优化,建立了检测美洲型PRRSV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法,同时与商品化荧光定量PCR试剂盒进行比对分析。结果表明,该方法特异性强,灵敏度高,能很好的区分美洲型猪繁殖与呼吸道综合征病毒和其他病毒。使用该方法对14份临床样品进行检测,阳性率85.7%,与商品化试剂盒符合率100%。 相似文献
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根据欧洲型N基因、美洲型M基因和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应体系和扩增条件,建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%;灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL;特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应,具有良好的特异性;临床试验表明,该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸;此外,本研究用欧洲型PRRSV质粒进一步验证了该方法可以检测出欧洲型PRRSV的目的基因。该方法的建立为不同类型的PRRSV快速检测提供了有效手段,可用于猪繁殖与呼吸综合征疫情的监测及防控。 相似文献
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欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法的建立 总被引：3，自引：2，他引：1
根据欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计E1和E6 2套PCR引物和TaqMan荧光探针,建立E1和E6荧光RT-PCR方法,用于检测PRRSV。反应条件优化后,用10倍倍比稀释的质粒DNA、cDNA进行PCR扩增以检测其灵敏度,同时对猪瘟(CSFV)、猪伪狂犬(PRV)等7种病毒进行特异性检测。结果显示,建立的E1和E6荧光RT-PCR可以检出欧洲型PRRSV,敏感性依次为616和216个拷贝的PRRSV重组质粒DNA,而CSFV等非PRRSV均为阴性。建立的E1、E6荧光RT-PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可作为检测欧洲型PRRSV的技术储备。 相似文献
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PRRSV和PCV-2二重PCR检测方法的建立及初步应用 总被引：1，自引：1，他引：0
参考GenBank上已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因序列和猪圆环病毒2型ORF1基因序列,分别设计并合成了可用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的2对引物,扩增目的片段大小分别为421 bp和714 bp。在建立了用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的单项PCR检测方法并优化单项PCR条件的基础上,建立了针对两种病毒的二重PCR检测方法。通过检测143份临床病料对二重PCR方法和单项PCR/RT-PCR方法进行了对比验证。结果显示,两者的总符合率在92.6%以上,表明该二重PCR检测方法可以用于临床病料的检测。 相似文献
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《中国兽医学报》2019,(9)
猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是目前影响养猪业的重要病毒之一,国内PRRSV是以美洲型为主,根据致病性的强弱又可分为高致病性(HP)和经典性PRRSV毒株,高致病性PRRSV是引起国内2006年"猪高热病"的主要病原。PRRSV属于条件性致病病毒,对PRRSV感染猪和发病猪的准确、快速检测是采取有效措施的前提和依据。环介导等温扩增技术(LAMP)是一种敏感、快速、操作相对简便的核酸扩增技术,整个反应在单一温度下进行,反应结果可以通过肉眼观察,在动物病原检测方面应用较多。本试验通过GenBank获得了HP-PRRSV和经典PRRSV分离株序列,选择2种毒株共同的保守基因区段,设计了用于检测PRRSV的RT-LAMP引物。通过对反应体系、反应温度、特异性、敏感性等优化,建立了检测PRRSV的RT-LAMP方法。建立的方法总体系为25μL,外引物终浓度为0.20μmol/L、内引物终浓度为1.60μmol/L,63.0℃恒温作用1 h,给反应产物中加入1μL SYBR GreenⅠ,阳性结果呈绿色,紫外光下可见荧光,阴性结果呈橙色,紫外光下无荧光。方法对PRRSV RNA的最低检测质量浓度为9.44×10~(-5) mg/L。用建立的方法对临床送检的19份猪样品(血清和组织)进行检测,与国标(GB/T 27517-2011)的HP-PRRSV和PRRSV双重RT-PCR检测方法进行对比,双重RT-PCR方法检测出6份阳性,RT-LAMP方法检测出8份阳性。本试验建立了检测PRRSV经典毒株和高致病毒株的RT-LAMP方法,为PRRSV的检测提供了可选择的方法。 相似文献
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为了解宁夏地区感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的基因型和遗传变异情况,收集2008~2014年宁夏4个地区临床疑似发病猪的血清和组织,病毒核酸提取后用特异性引物进行RT-PCR扩增、凝胶电泳和测序,鉴定9份阳性样品。并与国内外猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒代表毒株进行序列比和遗传进化分析。结果表明,9个毒株的ORF5基因中7株属于美洲IV型,2株属于美洲I型。说明宁夏流行的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒均属于美洲型,但病毒亚型之间已发生变异,为PRRSV遗传进化分析和疫病防控提供了新的参考。 相似文献