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1.
为快速、准确、灵敏检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）,以PEDV N基因为靶标设计引物,建立了一种PEDV SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。该方法最低可以检测到10个拷贝的病毒核酸,与猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒等胃肠道病毒均无交叉反应,批内、批间重复试验的变异系数均在2%以内,表明该方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。运用该方法对2018—2019年采集自山东省不同地区猪场的161份临床样品进行检测,检测结果与RT-PCR方法完全一致。以上结果说明,本试验所建立的SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法为PEDV的快速检测提供了良好工具和技术支持。 相似文献
2.
据猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV）S基因序列设计1对特异性引物,通过对实时荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法,同时对12份病料进行检测,并与常规RT-PCR进行比较。结果显示,该方法的敏感性达到43.07拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性,而常规RT-PCR最低只检测到4.307×103 拷贝/μL,敏感性较低。本试验建立的检测TGEV S基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法为传染性胃肠炎的鉴别诊断及TGEV的分离鉴定奠定了技术基础。 相似文献
3.
SYBR Green荧光RT-PCR法快速检测毛皮动物源犬瘟热病毒 总被引：3，自引：0，他引：3
根据犬瘟热病毒(CDV)H蛋白基因的保守序列设计了1对引物,经过各反应体系和反应条件的摸索和优化,建立了CDV的SYBR GreenⅠRT-PCR荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,建立的方法特异性较好,几种非CDV病原体检测均为阴性;敏感性实验表明其敏感性可达1个TCID50,高于普通RT-PCR和胶体金检测试剂盒;重复性试验表明所建立的检测方法非常稳定;临床检测中,在39份样品中检测到28份阳性样品,高于普通RT-PCR方法的检出率。该方法检测成本低、特异性强、敏感性高、重复性好,可推广应用于毛皮动物CDV的大规模高通量的检测。 相似文献
4.
为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL-1,其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R2=1.00。应用该方法检测了2018-2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。 相似文献
5.
《中国预防兽医学报》2021,(8)
为建立检测盖他病毒(GETV)的敏感、特异且快速的方法,本研究根据GETV E1基因的保守区域设计引物,通过反应条件的优化,建立了快速检测GETV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法。利用该方法对GETV以及临床猪常见病毒(PRRSV、PCV2、PRV、JEV、PTV、PSV)进行检测,结果显示该方法仅对GETV检测为阳性,而对其他病原均无特异性扩增,特异性强;以10倍倍比稀释后的质粒标准品pMD19-CETV为模板,采用该方法进行敏感性检测,结果显示本实验建立的该方法最低检测下限为6.87拷贝/μL,是常规RT-PCR方法的10倍,敏感性高;以不同稀释度的质粒标准品作为模板进行组内和组间的重复性试验,结果显示该方法组内和组间变异系数均小于1.5%,重复性好。利用该方法对35份临床流产死胎的猪脑组织样品进行检测,结果显示所有样品均未检出GETV,与普通RT-PCR方法检测结果一致。本研究首次建立的GETV SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可应用于对GETV的检测。 相似文献
6.
《畜牧兽医学报》2020,(2)
为建立一种快速检测猪星状病毒4型(PAstV4)的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,根据已知的猪星状病毒4型序列的ORF1a基因设计了特异性引物,并将扩增片段克隆到pMD19-T载体上;将构建的重组质粒作为标准品建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法,并对建立方法的灵敏性、特异性及重复性进行验证。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法最低检测量为50.3拷贝·μL~(-1),其灵敏度是普通PCR的100倍;与CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、PDCoV无交叉反应,特异性较好;建立的标准曲线呈良好的线性关系,相关系数R~2=1.00。应用该方法检测了2018—2019年收集的43份临床样品,阳性率为18.6%。本研究为猪星状病毒4型的临床检测建立了一种快速、灵敏、特异性强的方法。 相似文献
7.
空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示：建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数（CV）均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。 相似文献
8.
9.
《现代畜牧兽医》2018,(12)
为了建立BVDV快速诊断方法,针对BVDV基因组5’UTR序列保守区域设计了荧光定量PCR引物,并建立了快速检测BVDV的荧光定量PCR方法。结果表明,以构建的重组质粒pMD-5’UTR为标准品建立的SYBR Green荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.997 3;敏感性试验结果显示,该方法敏感性较好,其最低检测下限为10拷贝。重复性试验结果显示,该方法批内和批间的变异系数为均小于5%,表明该方法的重复性良好。特异性试验显示,该方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒不存在交叉反应,但其不可区别鉴定BVDV与猪瘟病毒。应用所建立的SYBR Green荧光定量PCR方法测定非致细胞病变型BVDV(BVDV-BJ-2016株)分离毒株的一步生长曲线,发现在感染后12～48 h为其对数生长期。该研究为研究非致细胞病变型生长特性提供了参考。 相似文献
10.
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《中国预防兽医学报》2018,(12)
为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。 相似文献
12.
为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。 相似文献
13.
为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。 相似文献
14.
15.
《中国预防兽医学报》2019,(1)
为建立猪肠道α冠状病毒(SeACoV)荧光定量检测方法,本研究采用RT-PCR方法扩增SeACoV N基因保守区序列,将其克隆至p EASY-Blunt载体,构建重组质粒p EASY-Blunt-PA-N作为标准阳性质粒,以其为模板建立SeACoV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性和重复性试验验证。结果显示,建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法 Ct值与标准品模板在9.47×101拷贝/μL～9.47×107拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.996,斜率为-3.91。本实验建立的方法对PEDV、TGEV、PDCo V、PRRSV等猪常见腹泻病样品检测无扩增,表明特异性良好;敏感性试验结果显示,该方法检测下限可达到9.47×101拷贝/μL;重复性试验结果显示,组内变异系数在0.82%～1.01%,组间变异系数在1.20%～1.69%,重复性较好。采用本研究建立的方法对广西和云南等地70份临床样品进行检测,结果显示除阳性对照外,临床样品均为阴性,表明该病毒尚未传播至广东以外的省份。本实验首次建立了SeACoV N基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,为SeACoV快速检测和病毒感染预防提供技术手段。 相似文献
16.
《养禽与禽病防治》2015,(12)
为了建立鸡传染性支气管炎病毒快速、敏感的检测方法,本研究利用RT-PCR技术扩增出鸡传染性支气管炎病毒M基因中134bp的保守序列,并克隆到pMD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了IBV的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达3.5×10~1拷贝,与禽呼肠孤病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生病病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床IBV的检测。 相似文献
17.
《中国兽医杂志》2017,(3)
为建立犬瘟热强弱毒株SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据Gen Bank公布的犬瘟热毒株的全基因序列并参考相关文献,选择M基因保守区域合成了1对通用引物M1/M4及鉴别犬瘟热强弱毒株的特异引物M2和M3。试验证明,该方法重复性良好;检测强弱毒株的最低检出限度在10拷贝;对新城疫病毒、水貂肠炎病毒、阿留申病毒、犬腺病毒、犬细小病毒5种病毒的特异性检测均为阴性;对175份犬瘟热疑似病料进行荧光定量RT-PCR,检出127份阳性样品,其中强毒株98份,弱毒疫苗株29份,常规RT-PCR检出112份阳性样品。结果表明,该方法的敏感性高于常规RT-PCR检测,并能有效的鉴别强弱毒株。 相似文献
18.
本试验旨在建立一种检测猪A组轮状病毒的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法.参考GenBank上登录的猪轮状病毒OSU株的VP6基因序列保守区设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法克隆目的基因,并将其连入pMD 19-T Vector,制备阳性标准品,优化反应条件.建立的方法在1.0×102～1.0×109拷贝/μL范围内线性关系良好,反应扩增效率大于90％,扩增相关系数大于0.98.对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒2型均检测不到荧光信号,表明该方法特异性强.该方法批内和批间变异系数均小于2％,重复性好.结果表明,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可为A组猪轮状病毒早期感染的诊断及病毒定量分析提供技术支持. 相似文献
19.
20.
为了建立兔出血症病毒(RHDV)快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出RHDVVP60基因中201bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了RHDV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达6×101拷贝,与兔水疱性口炎病毒和轮状病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床RHDV的检测。 相似文献