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逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达 总被引：5，自引：1，他引：4
为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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为研制FMD复制缺陷型腺病毒活栽体疫苗，通过RT—PCR方法获得了。型口蹄疫病毒（FMDV）全开放阅读框（oRF）基因片段，将其克隆到pMD18-T栽体后测序，再将oRF编码基因定向克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中，构建了重组腺病毒穿梭质粒。经PCR、酶切及测序鉴定，所克隆的oRF编码基因序列与原始强毒株Akesu／58的ORF编码基因比较，L、P1、P2、P3基因的核苷酸同源性分别为98．8％、97．9％、99．0％和97．6％，PCR、酶切鉴定重组腺病毒穿梭质粒均获得了长约6．9kb的目的基因片段。表明，成功获得了含有。型FMDV全ORF编码基因的阳性克隆，并成功构建了含有完整FMDV开放阅读框架的编码基因表达盒的重组腺病毒穿梭质粒。 相似文献
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以pT-P1质粒为模板,应用引物对P1-S2/P1-A2进行PCR扩增,获得口蹄疫病毒（FMDV）泛亚株全衣壳前体基因（P1）片段.用EcoRI 酶切并连接将P1克隆入表达载体pSOC中,以引物对Pr.78/P1-A2进行PCR扩增,鉴定P1基因插入方向正确.在大肠杆菌中以P1-SOC融合蛋白（约98ku）的形式获得高效表达（21%）.在0.5～3 mmol/L IPTG诱导浓度和37 ℃220 r/m振摇培养1～4 h条件下表达量保持稳定.表达产物经T4-3C蛋白酶作用,裂解后可产生多种蛋白.出现与抗口蹄疫血清反应的蛋白条带. 相似文献
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根据口蹄疫病毒（FMDV）china99流行毒株基因序列设计特异引物，以阳性质粒pGEM—p1为模板，扩增p1基因。p1片段经Nco1和Xho1酶消化后，得到目的基因VP2—3—1，将其与经相同酶消化的表达载体pProEx—HTb连接并转化BL21（DE3），经PCR、酶切鉴定和序列分析筛选阳性克隆，经IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果表明VP2—3—1基因得到表达；Western blotting结果显示，该表达蛋白能被口蹄疫病毒阳性血清所识别。 相似文献
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为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。 相似文献
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O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达 总被引：2，自引：0，他引：2
口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。 相似文献
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利用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出A群猪轮状病毒（PRV）G5型OSU株长度约为1．0kb的基因片段，将其克隆到pMD18-T载体上进行测序鉴定，证明为该PRV的VP7蛋白基因，与已发表的该PRV，VP7基因序列的同源性为99．8％，将该基因黏端克隆至表达载体PblusBAChis C质粒中，酶切及PCR鉴定表明获得了PRV－VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子，纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5d后收获重组病毒，通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定，确定PRV－VP7基因已正确投入，将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后，获得了重组杆状病毒PRV－VP7蛋白的真核表达。 相似文献
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猪传染性胃肠炎病毒S基因B、C位点的克隆及原核表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
参考GenBank上公布的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因B、C抗原位点序列,应用Primer6．0设计一对含酶切住点的引物,用于RT—PCR扩增B、C抗原位点目的片段,将扩增产物连接于peasy—T克隆载体上,构建克隆载体,用EcoRⅠ和XhoⅠ对表达载体PET-32a（＋）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（＋）多克隆位点上,连接、转化至BL21（DE3）,构建B、C位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。所扩增的目的片段的大小为357bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEVS基因B、C抗原位点的原核表达载体。TGEVS基因B、C抗原位点原核表达载体的成功构建,为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。 相似文献
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昆虫抗真菌肽Thanatin-CAD双价基因的合成、克隆及其表达 总被引：4，自引：3，他引：4
为促进昆虫抗菌肽基因在转基因抗病育种和生物工程制药的应用,通过设计嵌合引物结合分段PCR的方法将抗真菌肽Thanatin基因与Cecropin AD基因(CAD基因)融合拼接为Thanatin-CAD双价基因,采用T-A克隆法将其克隆至pGEM-T Easy载体,进行测序,结果证实与预期设计的完全一致;然后再将其亚克隆至表达载体pET-21d中,用IPTG诱导含重组表达质粒的菌株,对表达产物进行生物活性测定,初步结果显示Thanatin-CAD双价基因的融合表达产物对受试细菌无抑菌活性,但对部分病原真菌有较强的抑菌作用。 相似文献
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本试验旨在研究脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和长链脂酰辅酶A合成酶1(ACSL1)基因在鹅的不同组织器官中的表达差异,并探索2个基因表达对机体脂肪沉积和血清脂类代谢的调控。选取16周龄五龙鹅30只(公母各占1/2),屠宰后用实时荧光定量PCR检测不同组织器官(肝脏、心脏、皮下脂肪、腹部脂肪、胸肌、腿肌、肌胃、腺胃、小肠、肾脏、大脑、肺、脾脏)中A TG L、A CSL1基因表达量。结果表明:1)在鹅的皮下脂肪、腹部脂肪、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸肌和腿肌中均检测出ATGL和ACSL1基因的表达;ATGL基因在皮下脂肪和腹部脂肪中表达量最高,其次是肝脏和脾脏,在肾脏、心脏、胸肌和腿肌中只有少量表达;ACSL1基因在皮下脂肪、腹部脂肪、肝脏、脾脏中表达量较高,在肾脏、心脏、胸肌和腿肌中有少量表达,而在肌胃、腺胃和肺中几乎不表达。2)ATGL基因表达量与腿肌肌内脂肪率、胸肌肌内脂肪率、腹部脂肪率、胸肌率和腿肌率呈显著或极显著负相关(P0.05或P0.01),与皮下脂肪率呈显著正相关(P0.05);ACSL1基因表达量与腿肌肌内脂肪率、胸肌肌内脂肪率、胸肌率呈正相关(P0.05),与腿肌率呈显著正相关(P0.05),与皮下脂肪率呈显著负相关(P0.05)。3)ATGL基因表达量与血清甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和葡萄糖含量呈显著或极显著正相关(P0.05或P0.01);ACSL1基因表达量与血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和葡萄糖含量呈负相关(P0.05),与甘油三酯含量呈显著负相关(P0.05)。由此可见,ATGL和ACSL1基因在鹅的不同组织器官中的表达具有明显差异性,对机体脂肪沉积和血清脂类代谢具有反向调控作用。 相似文献
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干扰素的分子生物学研究进展 总被引：9，自引：1，他引：8
干扰素是一类多功能细胞因子，是由哺乳动物体细胞合成与分泌的潜在的生物活性蛋白质，具有抵抗病毒感染、抑制肿瘤细胞生长与调节机体免疫功能的作用，其基因表达受多种因素和调控元件的调节。干扰素基因工程和基因治疗研究引起了广泛的关注，目前已被应用于临床治疗。 相似文献
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犬瘟热病毒小熊猫株H、F和N基因的克隆及表达 总被引：4，自引：0，他引：4
根据GenBank中发表的犬瘟热病毒（CDV）的核苷酸序列，设计并合成了扩增CDVH、F和N基因的3对引物，经RT—PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株（LP株）H、F和N基因，并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明，CDV LP株属于强毒谱系，与CDV流行株的亲缘关系近．H基因含有较多潜在的糖基化位点．F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达栽体pVAX1的CMV启动子下游，构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN，体外转染BHK-21细胞．用间接ELISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠，从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体．初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物，可以激活机体的免疫应答。 相似文献
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为了建立猪源大肠杆菌对氟苯尼考、β-内酰胺类与粘杆菌素耐药基因的多重PCR检测方法,本研究以氟苯尼考耐药基因floR、β-内酰胺耐药基因CTX-M、粘杆菌素耐药基因mcr-1作为目的基因,设计3对特异性引物,通过对多重PCR反应体系及条件的优化,成功建立了多重PCR检测方法。该方法的灵敏度为1.46×10^5CFU/m L,具有高度特异性、敏感性和可重复性。本方法的建立为大肠杆菌中常见耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段。 相似文献
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陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒S、M和N基因的遗传变异分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为了解陕西省部分地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传和变异情况,采集陕西省部分地区规模化猪场的5份疑似PEDV感染的猪小肠内容物,进行PEDV S、M和N基因的RT-PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定和遗传变异分析。结果表明,5份病料均能扩增出PEDV S、M和N基因,5株病毒分别命名为SXSL、SX-BJ、SX-YL、SX-WN和SX-HZ株。序列分析表明,5株毒株之间的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为96.7%~99.8%、98.4%~100%和97.2%~99.9%;氨基酸序列的同源性分别为97.4%~99.9%、98.2%~100%和98.2%~100%。该5株病毒与中国疫苗株CV777的S、M和N基因核苷酸序列的同源性分别为93.9%~99.8%、98.1%~100%和95.3%~99.9%,氨基酸序列的同源性为93.6%~99.9%、96.2%~100%和98.2%~100%。遗传进化分析结果显示,5个陕西分离株的S基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远,与近年来中国株、日本株以及韩国株亲缘关系较近。SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较近,且与中国株CHGD-01亲缘关系密切。SX-WN株和SX-HZ株的M和N基因与中国疫苗株CV777亲缘关系较远。该5株病毒的S基因以及SX-WN株和SX-HZ株的M基因和N基因变异程度较大,而SX-SL株、SX-BJ株和SX-YL株三个流行株均与中国株CHGD-01亲缘关系密切,并且与近年在陕西省流行的PEDV也不完全相同。 相似文献
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采用RT—PCR方法对近年来本实验室分离的4株肾型IBV陕西分离株的纤突蛋白S1基因、膜蛋白基因（M）和核蛋白基因（N）分别进行扩增,测序后进行遗传变异分析。结果显示：与肾型疫苗株w93相比,各分离株S1基因均存在广泛的点突变,并且都存在基因插入现象,分离株之间氨基酸同源性为75．8％～99．4％;M基因除了存在点突变外,W09和WNl2在其5’端还存在9个核苷酸的缺失,分离株之间氨基酸同源性为91．0％～99．6％;N基N无插入和缺失,但存在基因点突变,分离株之间氨基酸同源性为99．3％～99．5％。4株IBV分离株在S1、M和N基因氨基酸系统进化树上分属于不同的进化群,且都与较早的肾型IBV陕西分离株w118遗传距离较远。结果表明,4株鸡肾型IBV流行毒株的s1、M和N基因均存在不同程度变异,这可能是免疫鸡群肾型鸡传染性支气管炎长期流行的主要原因． 相似文献