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1.
【目的】分析禽心包积水-包涵体肝炎综合征的主要病原禽腺病毒4型(FAV-4)在河南省的流行和遗传变异情况。【方法】对2015年8-10月送检的40份疑似FAV-4感染的病料进行PCR阳性检测,同时根据采集地区与宿主的差异性,选取7份FAV-4阳性样品进行了Hexon全基因的扩增、克隆、测序和遗传进化分析。【结果】通过扩增Hexon基因421bp的片段,成功建立了禽腺病毒4型的PCR检测方法;40份家禽肝脏样品中,PCR检测显示35份为FAV-4阳性,阳性率为87.5%;成功扩增了包含Hexon基因全序列的片段,长度为2 889bp;7株FAV-4河南株的Hexon基因与GenBank中的12株FAV-4参考毒株Hexon基因序列之间核苷酸序列同源性为98.5%~99.8%,与参考株相比存在碱基的插入、突变现象;FAV-4河南株Hexon全基因推导的氨基酸序列与参考株之间的同源性为98.2%~99.8%,且发生变化的位置集中在前段和中段。【结论】FAV-4河南株与印度分离株亲缘关系较近,但与韩国分离株亲缘关系相对较远。 相似文献
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为探讨血清4型禽腺病毒（FAdV-4）安徽流行株的基因组遗传变异特征及其感染途径与致病性的关系,选择2015-2020年6株FAdV-4安徽分离株进行全基因组测序与分析,并以CH/AHMC/2015株对10日龄SPF鸡进行不同感染途径（皮下注射、口服、点眼、滴鼻及其分别同群混养）的致病性试验。结果显示,6株FAdV-4安徽分离株的基因组全长均为43 719～43 723 nt,其核苷酸同源性达99.97%,与国内FAdV-4主要流行株同源性为99.56%～100%,与国外经典毒株ON1、KR5、MX-SHP95同源性为98.45%～98.78%;6株病毒与国内代表株HB1510具有13个核苷酸位点差异,并导致5个位点氨基酸变化,与国外经典毒株存在特征性差异。氨基酸分析显示,Hexon蛋白aa188、Fiber-2蛋白aa219和aa380 3个氨基酸位点存在一定的特征性,致病株主要为R、D、T,非致病株主要为I/V、G、A。进化分析显示,国内FAdV-4流行株与巴基斯坦、印度分离株的遗传关系最近。感染试验显示,皮下注射、口服、点眼、滴鼻4 组人工感染鸡的发病率和死亡率分别为100%、55%、50%、60%和90%、20%、40%、50%,各组同群混养鸡的发病率为20%～40%,仅皮下注射组混养鸡出现死亡,死亡率为20%。结果表明,2015-2020年FAdV-4安徽省流行株具有国内主要流行致病株特征,其不同感染途径的结果进一步揭示该病的临床流行特点,为该病防制提供科学依据。 相似文献
3.
【目的】研究福建南平地区禽腺病毒(FAdV)血清8a型分离株的遗传演化情况及致病性,旨在为防控血清8a型FAdV感染提供参考。【方法】2022年8月,采集福建南平地区部分肉鸡养殖场出现的以包涵体肝炎为特征的肝脏病料,采用PCR技术检测FAdV核酸,将获得的阳性样品接种在无特定病原体(SPF)鸡胚上进行病原的分离纯化,利用hexon基因测序及序列分析等方法进行病毒鉴定,并在测定分离株毒力的基础上进行动物致病性试验。【结果】接种10 d后,鸡胚死亡,肝脏肿大、出血、坏死、呈土黄色;PCR鉴定和hexon基因序列分析表明,分离株与GenBank上的FAdV E型8a血清型澳大利亚TR59毒株的序列同源性高达99.5%,将该分离株命名为FJNP。FJNP株对1日龄SPF鸡的致死率为44%(11/25);剖检显示,感染鸡肝脏肿大、出血、边缘钝圆、呈土黄色、出现白色坏死点,脾脏和肾脏也出现肿大、出血等症状;肝脏组织病理学检查结果显示,感染鸡肝细胞大量变性坏死,肝细胞核可见嗜碱性包涵体及大量淋巴细胞浸润。实时荧光定量PCR检测显示,感染鸡体内多个组织器官均检测到病毒,且主要分布在肝脏,攻毒3、5、7... 相似文献
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2018年11月,山东省某蛋鸡场80日龄左右鸡群出现采食下降、精神沉郁、消瘦等症状,日死亡率达1%,临床剖检病变主要为心包积液、肝脏有出血点、肾脏肿大等。为明确患病蛋鸡死亡原因及确定病原,无菌采取病死鸡肝脏、肾脏等,并展开病毒分离、PCR检测等实验室诊断,结果表明,病料接种鸡胚,胚体有明显出血症状,肝脏有出血点,PCR扩增产物测序结果与已发表的血清4型禽腺病毒Hexom基因同源性为99%。上述结果表明,该分离株为血清4型禽腺病毒。将分离到的腺病毒对2周龄SPF鸡进行攻毒试验研究其致病性,每日观察鸡的精神状态,记录死亡情况,发现胸肌接种0.3 mL/羽的病毒剂量对SPF鸡的致死率高达100%,死亡时间在72～144 h;对死亡鸡剖检均可见明显的心包积液,肝脏出血坏死;组织病理学观察发现肝细胞核内形成嗜碱性包涵体。 相似文献
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制备禽腺病毒4型（FAdV-4）Fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,将重组蛋白FAdV-4 Fiber2纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,分离脾脏中的淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到10株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8,取分泌抗体水平最高的1B5F1细胞株制备腹水,利用斑点杂交（Dot blot）和间接免疫荧光试验（IFA）进行特异性检测。结果表明,成功制备10株杂交瘤细胞株;制备的腹水能与FAdV-4 Fiber2蛋白及FAdV-4攻毒后的鸡肝组织产生特异性反应,证明成功制备了FAdV-4 Fiber2蛋白特异性单克隆抗体。 相似文献
6.
【目的】分析1株血清4型禽腺病毒（FAdV-4）流行株的分子特征及其感染对细胞因子的影响。【方法】采集安徽省某禽类养殖场疑似心包积水 肝炎综合症的鸡肝脏组织样本,用鸡肝癌细胞（LMH）对病原进行分离,采用PCR、透射电镜（TEM）观察和间接免疫荧光试验（IFA）对分离的毒株进行鉴定。采用分段扩增后拼接的方法克隆分离毒株的全基因组,对其进行遗传进化分析和序列重组分析。基于柯赫法则,用分离毒株接种无特定病原体（SPF）鸡,检验其致病性。采用实时荧光定量PCR法,检测分离毒株对LMH细胞天然免疫相关细胞因子环鸟苷酸-腺苷酸（cGAS）、干扰素刺激因子（STING）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、干扰素-α（IFN-α）、IFN-β、干扰素调节因子7（IRF7）、线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）、主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ-α、MHCⅡ-β等11种细胞因子的诱导作用。【结果】分离鉴定到1株FAdV,其在LMH细胞中培养未出现明显细胞病变效应;病毒粒子直径为70~90 nm,符合FAdV-4的结构特征;免疫荧光试验结果显示,在接种分离毒株的LMH细胞内可观察到亮红色荧光,而对照细胞没有荧光;将该毒株命名为FAdV-4-AH-F41。采用分段扩增后拼接的策略获得了FAdV-4-AH-F41全基因组序列（43 708 bp）;遗传进化分析和序列重组分析发现,FAdV-4-AH-F41与FAdV-4株核苷酸相似性为99.6%;存在3个重组事件,第1个重组事件发生在30 453-30 674 bp,第2个发生在36 884-36 988 bp,第3个发生在43 401-43 715 bp。致病性试验显示,FAdV-4-AH-F41是导致鸡心包积水-肝炎综合症的病原。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照（DMEM/F12处理）相比,用FAdV-4-AH-F41处理后LMH细胞中11种免疫因子的表达量水平均有提升,其中cGAS、IL-6、IRF7、MHCⅡ β差异达极显著水平（P<0.01）,IL-1β、IFN-α、MAVS差异达显著水平（P<0.05）,STING、IL-8、IFN-β、MHCⅠ-α差异不显著。【结论】成功分离1株重组血清4型禽腺病毒,感染LMH细胞会诱导强烈的天然免疫反应。 相似文献
7.
为建立禽腺病毒4型的禽源细胞感染模型,并考察细胞培养毒株对动物的致病性,将实验室2014-2017年间分离的5株血清4型禽腺病毒接种鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells,LMH)并盲传,选取各病毒的LMH细胞培养物,按一定剂量经腿部肌肉注射接种4周龄SPF鸡;记录试验动物的发病情况,剖检采集发病或死亡鸡的脏器并制作病理切片,观察并分析病毒细胞培养物感染SPF鸡的组织病理变化。结果发现:5株血清4型禽腺病毒在LMH细胞上盲传至第4代时开始出现I群禽腺病毒所致的特异性细胞病变,提取培养物中病毒核酸并进行PCR鉴定,均能扩增出大小约564bp的特异性扩增片段,表明病毒能在LMH细胞上稳定增殖。选取各病毒第10代细胞培养物进行SPF鸡回归试验,发现细胞培养上清接种4周龄SPF鸡后第3天开始,有部分鸡开始精神沉郁,食欲消退、卧地不起瘫痪并迅速死亡,病理剖检及病理组织切片结果显示HB-1、HB-2、HB-3和SD-1毒株保持对4周龄SPF鸡的致病性,病死鸡中能观察到典型的组织病理学变化,而对照组不出现任何临床症状及病理变化。以上结果表明,LMH细胞可用于禽腺病毒增殖传代,是开展禽腺病毒分子致病机制研究的理想细胞模型。 相似文献
8.
[目的]对广东地区疑似心包积液–肝炎综合征患病鸡进行腺病毒分离鉴定并研究其分子特征.[方法]采集的病料样品,通过鸡胚有限稀释法经SPF鸡胚传代分离纯化病毒,进行致病性试验,并对病毒的hexon、fiber-2、ORF19和ORF29基因进行PCR扩增,分析其分子特征.[结果]hexon基因序列分析显示此次分离的毒株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型(命名为WM-XC株),SPF鸡接种分离毒株后,致死率达90%,死亡鸡只出现明显的心包积液、肝炎等变化,肝脏病理切片可观察到明显的嗜酸性包涵体,显示分离毒株具有致病性.fiber-2基因序列同经典毒株ON1和KR5相应序列的相似性达96.1%和97.0%,与2015年以来国内分离的毒株序列相似性则达到100%;ORF29序列与2013年国内分离到的毒株JSJ13和JN13的相应序列相比存在33个碱基的缺失;WM-XC分离株与2015年以来国内分离毒株序列相同,但相比经典株ON1和KR-5,缺失ORF19序列.[结论]此次从广东地区分离到的血清4型Ⅰ群腺病毒,和近年国内其他地区分离的流行毒株一样,其fiber-2、ORF19和ORF29基因序列与经典毒株差异明显. 相似文献
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禽腺病毒细胞病变观察和半数组织感染量测定 总被引：4，自引：0，他引：4
从贵州省的患病鸡群中分离出一株禽腺病毒，暂定名为ＨＳ－１。ＨＳ－１毒株鸭胚成纤维细胞上生长良好，第１代即出现明显的细胞病变，细胞培养上清液中病毒的血液效价达到２＾１３。采用交叉血凝抑制试验证实，贵州分离毒ＨＳ－１的标准毒株Ｖ－１２７属于同一血清型或相关血清型，其半数组织感染量经室０＾－２．５８／０．１ｍｌ。 相似文献
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分别采用H_(91-1)和Y_(81)G_1两株禽腺病毒通过滴鼻、口服和肌肉注射,人工感染SPF产蛋鸡、伊莎蛋鸡,在感染后第3～20天的不同时期,分别扑杀感染鸡,无菌采集各脏器组织,应用荚心ELISA和血凝(HA)试验检测病料及鸭胚分离病毒。结果表明,H_(91-1)和Y_(81)G_4两株禽腺病毒对SPF蛋鸡和普通蛋鸡的咽喉部、卵巢、输卵管(蛋白分泌部、峡部、子宫部)均有亲嗜性。最早在感染后第3天即能检出病毒,感染后第6～15天检出率最高,输卵管峡部是检测和分离病毒的最佳部位。 相似文献
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猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建 总被引：2，自引：0，他引：2
通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用 总被引：1，自引：0，他引：1
以猪白介素2基因(pIL-2)为研究对象构建表达pIL-2的重组腺病毒,并研究其作为细胞因子佐剂的免疫增强作用。用RT-PCR的方法扩增pIL-2基因,将pIL-2基因克隆到腺病毒穿梭载体AdTrack中,构建出重组腺病毒穿梭质粒AdTrack-pIL-2,然后在大肠杆菌BJ5183内和骨架载体AdEasy同源重组,获得重组腺病毒骨架载体AdEasy-pIL-2,转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒Ad-pIL-2,并通过兔体交互试验来检测Ad-pIL-2的免疫增强作用。经PCR、RT-PCR和Western blot检测,成功构建了Ad-pIL-2,病毒滴度可以达到108.25pfu/mL,并通过兔体交互免疫试验证明Ad-pIL-2可以提高兔的抗体水平。用腺病毒构建的Ad-pIL-2在兔体上具有免疫增强作用,为下一步的猪体试验研究和细胞因子佐剂的开发奠定基础。 相似文献
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猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建 总被引：1，自引：4，他引：1
通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
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对腺病毒的结构、转录和复制特性进行了较全面的介绍,回顾了腺病毒载体的发展历程,同时对各种动物腺病毒的现状进行了描述。进一步分析了腺病毒载体易于构建和操作、宿主范围广、感染性强等特性的分子机制。因其具有广泛的组织亲和性,腺病毒成为表达和传递治疗基因的主要候选者。随着动物腺病毒载体的发展,它将在控制人和动物传染性疾病,特别是病毒性传染病以及人类的基因治疗中发挥越来越重要的作用。 相似文献
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猪的病毒性疾病种类多且危害大,因此研发具有广谱抗病毒作用的猪α干扰素制剂具有重大意义.为了研制重组猪干扰素类制剂防制猪病毒性传染病,构建了携带猪IFN-α基因的重组腺病毒.应用PCR方法从猪肝组织基因组中扩增得到猪IFN-α基因后,直接克隆入腺病毒载体穿梭质粒中,构建出腺病毒重组穿梭质粒pAd-CMV-IFN-α,经Pme Ⅰ线性化后转化BJ5183感受态细胞,获得同源重组腺病毒质粒,Pac Ⅰ酶切后回收,脂质体介导下转染AD-293细胞,PCR检测表明成功构建了携带猪IFN-α基因的复制缺陷性重组腺病毒. 相似文献
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以pUC18载体为骨架质粒,犬2型腺病毒(canine adenovirus 2,CAV-2)Tomnto A26/61株为亲本毒株,以复制非必需区E3的侧翼序列为同源重组臂,对外源基因的插入靶点E3区进行了缺失,并在缺失位置插入hCMV IE启动子、多克隆位点,增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)、SV40早期转录poly-A信号,构建了E3区缺失的转移栽体pUC-△E3-EGFP.该载体与CAV-2亲本毒株共转染MDCK细胞,二者发生同源重组,经蚀斑筛选获得了表达EGFP的重组病毒rCAV-2△E3-EGFP.经鉴定重组病毒保持了亲本毒株的生物学性状并能够稳定表达外源基因,动物试验证实E3区的缺失对病毒的致病力无明显影响,为进一步开展CAV-2活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台. 相似文献
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目的为改进构建野生型抑癌基因PTEN重组腺病毒表达载体的方法。方法用抑癌基因PTEN与带有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pAdTrack-CMV重组后转化含腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.coliBJ5183(Ad-1 cells),以获得重组腺病毒质粒,经限制酶PacⅠ线性化后,转染293细胞,检测PTEN蛋白的表达,并以Ad-PTEN感染人乳腺癌MCF-7细胞后,测其感染率。结果获得PTEN基因的重组腺病毒表达载体(Ad-PTEN),受Ad-PTEN转染的293细胞发生肿胀或圆缩的形态改变,经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因PTEN,荧光显微镜下能观察到293细胞内有绿色荧光。通过Western blot可检测到293细胞中PTEN蛋白高效表达。Ad-PTEN感染的人乳腺癌MCF-7细胞,感染率达80%~90%。结论PTEN重组腺病毒表达载体可在细菌体内进行同源重组而构建,方法较简便、快速,且生成的病毒滴度高、感染率高。 相似文献
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用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照组猪全部死亡;在攻毒前,重组腺病毒免疫组抗体水平普遍较低,商品化疫苗免疫组能100%检测到抗体,而非重组腺病毒和空白对照没有检测到抗体;攻毒后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组中分别有75%,50%和50%猪体温超过40℃,常规苗试验组80%体温超过40℃,而PAD-CMV组和空白对照组所有试验猪体温均超过40℃,表明重组腺病毒疫苗具有一定的保护效果。表明,仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离;含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。 相似文献
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以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础. 相似文献