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1.
本研究通过基因克隆技术以伪狂犬病病毒(PRV)弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作为同源重组序列,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)作为筛选标记,构建了带LoxP位点的pUCTKAB-EGFP质粒,将pBeloBACII线性化后插入到pUCTKAB-EGFP中构建了转移载体pUCTK-EGFP-BACII.将PRV基因组和转移载体共转染Vero细胞,利用同源重组在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC质粒和绿色荧光蛋白筛选标记,经过11轮噬斑纯化和鉴定证实获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC.通过噬斑试验和一步生长曲线测定等方法对重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC的生长特性进行研究,结果发现带有BAC质粒及筛选标记的重组病毒rv-PRVBAC在体外细胞培养中的增殖速度与亲本毒Bartha K61株相比没有明显差别,说明大的基因片段的插入没有影响重组病毒在体外的繁殖速度.重组病毒rv-PRVBAC在Vero细胞上盲传18代,其绿色荧光蛋白仍能够稳定表达,通过PCR鉴定可以检测到插入的外源片段和插入位点两侧的病毒基因序列,表明所获得的重组病毒rv-PRVBAC得到了稳定遗传.本研究成功获得了带BAC质粒的重组伪狂犬病毒rv-PRVBAC,为进一步开展PRV的细菌人工染色体的构建奠定了基础. 相似文献
2.
《中国兽医学报》2020,(2)
根据GenBank中公布的猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)US区基因序列(KJ789182),设计2对特异性引物,扩增PRV NY株gE/gI基因两侧序列,克隆至pUC-19载体,构建转移质粒pUC-gE/gILR,同时插入绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因,构建转移质粒pUC-gE/gILRE,作为重组同源臂。以PRV NY流行株为亲本株,将其基因组与转移质粒pUC-gE/gILRE共转染ST细胞,通过筛选绿色荧光蚀斑,获得含有荧光蛋白的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~--EGFP~+。再以该毒株基因组与转移质粒pUC-gE/gILR进行同源重组,通过筛选无荧光蚀斑,纯化重组病毒,经PCR扩增、测序,证实获得了去除EGFP基因的重组病毒rPRV NY-gE~-/gI~-。该重组病毒在ST细胞上培养时,与亲本株PRV NY具有相似的生长曲线,但该重组病毒的体外生长动力学比亲本株弱。本研究成功构建了1株针对目前PRV流行株的gE/gI双基因缺失病毒,为我国根除PR提供技术支持。 相似文献
3.
《中国预防兽医学报》2016,(2)
为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)F基因的重组鸭肠炎病毒(DEV),本研究以实验室前期构建的表达绿色荧光蛋白的重组DEV(r DEV-US10-EGFP)为基础,通过PCR扩增NDV F基因,构建了携带F基因表达盒的转移质粒p US10-TPA-F。将转移质粒与r DEV-US10-EGFP基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞。经过反向蚀斑筛选,获得表达NDV F基因的r DEV-US10-F。对重组区域US10基因测序结果表明,F基因正确插入至US10基因编码区内。将重组病毒传至15代,F基因仍能够稳定表达,表明重组病毒具有稳定的遗传特性,并且与亲本病毒株具有相似的生长曲线。本研究为研发NDV-DEV活载体疫苗奠定了基础。 相似文献
4.
5.
为了构建口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗株 ,将口蹄疫病毒 (FMDV) P1基因插入到伪狂犬病病毒 (PRV)通用载体 p Pg G- uni中 ,得到 PRV转移载体 p Pg G- P1。将转移载体与 Eco R 线性化后的 PRV弱毒疫苗株 TK- /g G- / lac Z 基因组 DNA共转染 PK- 15细胞 ,转染产物经多次空斑纯化和 PCR鉴定 ,获得了纯化的重组 PRV TK- /g G- / Pg G- P1,重组病毒基因组 DNA经酶切鉴定进一步表明 ,FMDV的 P1基因已成功地整合到 PRV弱毒疫苗株的基因组中。Western blot试验表明 ,FMDV P1基因在重组 PRV中得到表达。该研究为进一步研制口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗奠定了坚实的基础 相似文献
6.
《中国动物传染病学报》2017,(2)
近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2018,(10)
为构建猪源伪狂犬病病毒(PRV)变异株AH02LA的细菌人工染色体(BAC),本研究将转移载体pHA2-pUC19-H1-H2的DNA与PRV AH02LA株基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)进行同源重组,利用转移载体中的GFP为筛选标记,获得携带GFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV-AH02LA(gE-/gI-)-pHA2。提取纯化的该重组病毒DNA转化E.coli DH10B,对获得的阳性克隆命名为BAC~(PRV-G)。提取BAC~(PRV-G)的DNA,将含gE、gI和其上下游同源片段的DNA与BAC~(PRV-G)的DNA共转染CEF,获得gE、gZ基因恢复的病毒命名为PRVAH02LA~(Rec)。比较亲本株PRV AH02LA、基因缺失株和恢复株的生长动力学,结果表明,恢复株的生长特性与亲本株无显著差异。本研究成功构建了PRV变异株AH02LA的BAC,并证实其为全基因组的感染性克隆,为PRV变异株的致病机理研究和新型疫苗研制提供了重要的平台。 相似文献
9.
表达高致病性猪蓝耳病病毒GP5重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定 总被引：3，自引：0，他引：3
将PCR扩增的高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)HuN4株GP5基因与含绿色荧光蛋白(EGFP)基因的表达盒插入到伪狂犬病毒通用转移载体pgG-uni中,构建了转移载体pgG-HPGP5-EGFP.通过磷酸钙法将转移载体pgG-HPGP5-EGFP和PRV Bartha-K61株的基因组共转染Vero细胞,经过8轮荧光蚀斑筛选和PCR鉴定获得了稳定表达EGFP的重组病毒,命名为rPRV-HPGP5.WA和western blot结果证实HP-PRRSV HuN4株GP5在重组病毒中得到了有效表达.该重组病毒的获得为高致病性猪蓝耳病基因工程疫苗的研究奠定了基础. 相似文献
10.
《畜牧兽医学报》2016,(10)
拟构建一种新型火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组细菌人工染色体(BAC),通过同源重组方法将mini-F载体插入HVT基因组的糖蛋白C(glycoprotein C,gC)基因的等位位点得到mini-F重组HVT,提取重组病毒的DNA转入大肠杆菌DH10B细胞,再转入GS1783细胞获得BAC,拯救病毒获得mini-F重组病毒和gC恢复病毒后,与亲本病毒(HVT FC126)比较生长动力学和对鸡马立克病的免疫效力。结果:获得数个BAC阳性克隆,取其中一个克隆(BAC~(HVT-G))成功拯救出HVT mini-F重组病毒(HVT~(BAC-ΔgC)),并成功获得了gC恢复毒株(HVT~(BAC-gC-R))。生长特性和免疫效力试验表明HVT~(BAC-gC-R)与HVT FC126无显著差异,而HVT~(BAC-ΔgC)增殖能力和免疫效力均明显下降。成功构建了HVT全基因组的感染性BAC;HVT的gC基因是一个非必需基因,但对病毒的增殖能力和免疫效力有重要影响。 相似文献
11.
试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为107.34/0.1 mL和107.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。 相似文献
12.
为了构建伪狂犬病毒容A株(PRV-Ra)TK基因缺失重组病毒,本研究利用PCR从PRV-Ra株基因组分别扩增TK基因两侧的序列LTK和RTK,将LTK和RTK克隆到pUC19载体,构建转移质粒pUC19-TK/HEK。进一步将增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达盒克隆到pUC19-TK/HEK质粒中,构建转移质粒pUC19-TK/EGFP。用pUC19-TK/EGFP与PRV-Ra株基因组共转染BHK21细胞,通过噬斑纯化获得重组病毒PRV/TK-/EGFP;用pUC19-TK/HEK与PRV/TK-/EGFP病毒基因组共转染BHK21细胞,噬斑纯化获得不含EGFP基因的重组病毒PRV/TK-。该重组病毒在体外传30代后仍其有良好的遗传稳定性;PRV/TK-体外增殖速度、对家兔的毒力以及对仔猪的安全性和抗体反应性研究表明,重组毒株与原始株(PRV-Ra)在BHK21上具有相似的增殖规律;PRV/TK-对家兔的毒力比PRV-Ra下降了10000倍;以105.0TCID50PRV/TK-免疫小猪后4周,体内产生的平均中和抗体水平达101.9,略高于对照疫苗产生的抗体水平(101.8)。本试验为PRV基因功能的研... 相似文献
13.
利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。 相似文献
14.
通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒（MDV）2.8kbgB基因，并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ位点。然后用PstⅠ/NotⅠ酶切回收gB片段，插入到转移载体pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ/NotⅠ酶切位点处，构建了转移质粒pEFgpt12s-gB。将该质粒与鸡痘病毒（FPV）野毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过MXHAT选择培养基进行筛选，蚀斑纯化，经PCR扩增证实重组病毒中含有gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别，病毒效价分别为10^-5.43TCDID50/mL和10^-6TCID50/mL，表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性。 相似文献
15.
猪2型圆环病毒与O型口蹄疫病毒二联重组鸡痘病毒的构建和筛选 总被引：2，自引：1，他引：1
以pUTA2LacZ为真核表达载体,以中国流行株O型口蹄疫病毒(FMDV)NY00株结构蛋白前体P1基因、猪2型圆环病毒内蒙株的衣壳蛋白和复制蛋白基因为目的基因,构建了2个重组质粒作为中间转移质粒,标记为pUTALP1-ORF2和pUTALP1-ORF20RF1.将这2个重组转移质粒分别酶切鉴定后,与鸡痘病毒野毒(FPV)282E4株共转染鸡胚成纤维细胞.结果显示,重组核酸质粒构建正确,并能进行表达.经5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)加压筛选,挑取单个蚀斑,3次纯化,获得2株重组毒vpUTALP1-ORF20RF1和vpUTALP1-ORF2.结果表明,这2株重组鸡痘毒在电镜下可形成完整的病毒粒子. 相似文献
16.
为研究马立克氏病毒(MDV)新型疫苗及MDV致病机理,将MDV强毒GD0908株的全基因组作为细菌人工染色体(BAC)转化进大肠杆菌,构建GD0908株的感染性克隆.利用同源重组将BAC载体插入MDV基因组的US2区,将包含BAC载体的MDV DNA电转化入大肠杆菌菌株DH10B,最后将鉴定成功包含GD0908株全基因组的BAC DNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF),成功拯救出重组病毒,命名为rGD0908,其与父代病毒GD0908株在CEF细胞上的生长速度没有差异.该感染性克隆将为MDV的相关研究提供技术平台. 相似文献
17.
《中国兽医学报》2016,(9):1476-1483
参考GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)(M38367.1)基因序列,设计1对可以扩增出约1.6kb PPV VP2基因片段的特异性引物,上、下游引物的5′端均引入BamHⅠ酶切位点,PCR扩增得到VP2目的片段后,连接到pMD18-T载体中得到重组质粒pMD-VP2。取本实验室构建的含绿色荧光蛋白标记基因的伪狂犬病毒(PRV)通用转移质粒pG和构建好的pMD-VP2质粒,用BamHⅠ对质粒pG和pMD-VP2进行酶切,然后用CIAP对酶切产物进行去磷酸化处理,纯化回收后将VP2基因插入pG质粒中获得重组伪狂犬病毒转移质粒pGVP2。用脂质体转染法将PRV HB-98株全基因组与质粒pGVP2共转染ST细胞,得到携带有PPV VP2外源抗原基因和绿色荧光蛋白标记基因的重组伪狂犬病毒rPRV-VP2株。结合VP2基因PCR扩增和绿色荧光观察,经5轮病毒空斑纯化得到了纯化的重组病毒rPRV-VP2株。 相似文献
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应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因，继而构建出真核表达载体pVAX—VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上，筛选出VPl表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子，获得转移载体。再经酶切，连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞，转染3次后，细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定，证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2／FMDV。经验证，该重组毒可稳定遗传，其毒价为10^3.5TCID50／mL。 相似文献
19.
本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒(MDV)感染性克隆基因组中细菌人工染色体(BAC)序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒。将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1~10代不同代次SC9-1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示,1~5代病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列。6~10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7%以上。结果表明,利用cre/loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDV meq基因缺失株SC9-1的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。 相似文献
20.
本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡ-CAV-2为基础,以8202株狂犬病病毒基因组为模板,通过PCR扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区基因(8202-G″)。通过MluⅠ和EcoRⅠ双酶切pPolyⅡ-CAV-2质粒,获得含有Ⅸ蛋白的340bp片段,将其克隆入pEGFP-C1-dAseⅠ质粒中,构建pEGFP-SIX载体,该载体经AseⅠ单酶切插入8202-G″,即在编码Ⅸ蛋白基因的最后密码子与终止密码子之间按与Ⅸ蛋白编码链相同转录方向插入8202-G″基因,获得重组基因组质粒和pPolyII-CAV-2-ⅨG(34.8kb)。酶切鉴定结果显示,目的基因均克隆进Ⅸ蛋白中。 相似文献