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从猪肌生成抑制素(MSTN)cDNA序列中设计引物。以pMD18-T-MSTN质粒为模板，PCR扩增猪MSTN成熟蛋白编码序列，该片段全长1095bp。将所得片段与pMD18-T载体连接，构建重组质粒pMT—mpMSTN，将其转化到大肠杆菌DH5a中，成功地筛选到阳性克隆。双酶切重组质粒pMT—mpMSTN和真核表达载体pcDNA3．1，连接目的片段与载体pcDNA3．1，转化大肠杆菌DH5a，经酶切、PCR及测序分析，表明成功地构建了真核表达质粒pcDNA3．1-mpMSTN。 相似文献
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口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA的克隆及序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据口蹄疫病毒基因组的结构特点以及GenBank上公布的全序列，用DNAMAN分别设计了涵盖整个基因组序列的3对引物，从接种口蹄疫病毒WFL株的细胞培养液中提取了病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法和RACE法分别扩增了3条基因片段，并将扩增片段分别与T载体连接，在体外分别进行了5-半分子和3’半分子的构建。最后将5’半分子和3’半分子连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定、酶切鉴定及全长cDNA测序，证实成功构建了口蹄疫病毒wFL株基因组全长eDNA分子。序列分析结果表明，供试口蹄疫病毒基因组全长为8155nt，5＇UTR长1059nt；具有一个大的读码框，其核苷酸长度为6969nt。包括201aa的前导蛋白基因和2122aa的聚合蛋白基因；3＇UTR长127nt，包括34nt的polv（A）。 相似文献
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利用长距离RT-PCR技术扩增病毒基因组3'端覆盖口蹄疫病毒Asial/JS/China/2005株近全长的3个片段(共约7.5 kb),并利用单一酶切位点将其分别克隆到pBlueseriptSK+载体上.利用融合PCR扩增到基因组5'端含有15个C碱基的基因片段(约700 bp),并将其连接至pGEM-T载体.最后将这4个片段的阳性克隆装配至剔除T7启动子的低拷贝载体pcDNA3.1/Zeo(+)中构建该病毒株的全长cDNA克隆.以构建的FMDV Asial/JS/China/2005株全长cDNA为模板,使用TTRNA聚合酶在体外转录得到病毒RNA,通过脂质体将其导入BHK细胞获得拯救病毒.对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察和乳鼠致病性分析结果证实,通过体外转录获得了具有感染性的口蹄疫病毒.该株感染性克隆的构建为深入研究口蹄疫病毒的致病机制及研制新型疫苗等奠定了基础. 相似文献
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提取猪源FMDV China99/S组织样品总RNA,利用设计的引物对,分段进行扩增,获得覆盖全基因组的4个重叠片段(A、B、C和E),然后用BsmB Ⅰ/Xma Ⅰ、Xma Ⅰ/BamH Ⅰ、BamH Ⅰ/Not Ⅰ、Hpa Ⅰ/Kpn Ⅰ分别双酶切A、B、E、C,并纯化回收,依次定向克隆到带有聚合酶Ⅰ的pPⅠ cDNA3.1(+)转录载体内,最终得到重组质粒pP1-FMDVcDNA3.1(+);然后对该质粒进行序列测定.结果表明,China99/S株基因组全基因组序列长8 116 nt(含Poly(C)和Poly(A)片段),其中5′NCR长1 064 nt,蛋白编码区核苷酸序列为6 318 nt,编码1个由2 106个氨基酸组成的聚合蛋白,3′NCR长93 nt,其后是含有38个A碱基的Poly(A)尾.其中5′NCR引入含41个C的Poly(C)片段.将pPⅠ FMDVcDNA3.1(+)用脂质体转染法导入BHK-21细胞,传代培养,可以观察到典型的FMDV致细胞病变效应.利用CPE、电镜、动物试验、RT-PCR和序列测定进行检测,结果表明,从该系统中成功拯救出具有感染性的猪源FMDV China99/S株重组病毒. 相似文献
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堆型艾美球虫广东株3—1E基因的克隆与序列分析 总被引：2，自引：1，他引：2
根据GenBank中登录的堆型艾美球虫3—1E基因序列，设计了3条引物，以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了3—1E基因部分片段，将这一片段克隆至pGEM—TEasy载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现，所克隆的基因片段与Eimeria acervulina美国株(US)、E.acervulina QH株3—1E cDNA的核苷酸同源性分别为99．0％和99．2％，推导氨基酸的同源性分别为98．2％和97．6％。 相似文献
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从法氏囊组织分离IBDV超强毒株HK46并提取基因组RNA。以RNA为模板进行反转录合成cDNA第一链。采用长PCR扩增技术获得VP2－4－3 cDNA全长片段。将PCR产物克隆到pcDNA3.1( )载体，得到重组质粒pPP1。对pPP1插入片段全长序列进行了测序并对其序列进行了分析。结果表明，VP2－4－3 cDNA阅读框架由3039bp组成，可编码1012个氨基酸组成的前体多聚蛋白。经比较得知，HK46超强毒株VP2－4－3氨基酸序列与经典毒株间存在19－28个氨基酸的差异；与Harbin强毒株相差32个氨基酸；而与超强毒株OKYM和UK661分别相差2和6个氨基酸，且它们的VP2序列完全相同。在HK46超强毒株所特有的9个氨基酸中，3个位于VP2可变区，显示超强毒株其抗原性存在着变异。 相似文献
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口蹄疫病毒O／China／99株VP1基因植物种子特异性表达载体的构建及农杆菌的导入 总被引：4，自引：0，他引：4
根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDV VP1的核苷酸序列设计并合成引物，从种子特异性启动子7S质粒pU8—2质粒中扩增7S启动子，经HindⅢ和BarnHⅠ酶切，与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接，经酶切、PCR鉴定及序列分析，种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDV VP1基因的pGEM—VP1质粒中扩增VP1基因，经BarnHⅠ和SalⅠ双酶切后，与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接，经酶切、PCR及测序鉴定，FMDV VP1基因已置于种子特异性启动子7S下游，成功构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438-VP1。通过三亲交配法，将表达载体p7SBin438-VP1导入根癌农杆菌，为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。 相似文献
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猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03全长cDNA克隆的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
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猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株基因组全长cDNA克隆的构建 总被引：3，自引：0，他引：3
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中国猪瘟C-株(脾淋毒)全长cDNA的分子克隆 总被引：9，自引：1，他引：8
应用RT-PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从实验感染兔脾组织的总RNA中得到了覆盖猪瘟病毒(CSFV)C-株全基因组的7个cDNA重叠片段，分别克隆于pMD18—T或pGEM-T Easy载体后进行测序。运用T-A克隆和多片段一步连接法，将cDNA重叠片段F1、F2、F3、F4与F5、F6、F7分别克隆到pGEM-5Zf( )载体后，得到两个半长cDNA亚克隆重组质粒pGEM-5Zf( )／F1-4和pGEM-5Zf( )／F5-7。再将两个半长cDNA重叠片段连接并克隆到pGEM-5Zf( )载体，构建出了CSFVC-株全长cDNA重组质粒pGEM-5Zf( )／F1-7。全长cDNA的成功构建为进一步研究CSFV分子生物学提供了良好的工具。 相似文献
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中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析 总被引：1，自引：0，他引：1
根据已发表的猪瘟病毒（CSFV）序列设计并合了26条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT－PCR、Nested PCR和Half-nested PCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段，分别克隆和测序，构建了C株全基因组cDNA文库，采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CSF C株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础。 相似文献
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试验利用PCR技术扩增并获得了人IL-3、GM-CSF和人溶菌酶(human lysozyme,Hly)基因组基因编码区序列,人IL-3和GM-CSF基因PCR产物与pMD19-T连接,Hly基因PCR产物同pEASY-Blunt载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,蓝白斑筛选后经PCR及酶切鉴定,选取测序正确的克隆连接到pIRESneo载体中构建相关真核表达载体,分别用这些基因的表达载体转染PK15细胞,48 h后提取转染细胞的总RNA,并采用RT-PCR方法获得了人IL-3、GM-CSF和Hly基因的cDNA,结果发现,所获得的cDNA序列同NCBI登录的序列完全同源。 相似文献
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利用RT—PCR技术扩增口蹄疫病毒（FMDV）编码RNA依赖的RNA聚合酶的3D基因，经测序确认后将其克隆到真核表达质粒载体pcDNA3．1（＋）中，重组质粒pcDNA3．1（＋）-3D经HindⅢ、XbaⅠ双酶切后转染至BHK-21细胞。用纯化的目的蛋白进行Western—blotting鉴定，并预测该3D基因表达产物的三级结构。结果显示，获得分子质量约55ku的单一3D基因表达产物，其三级结构较为保守。利用RNA细胞内复制体系和荧光定量RT-PCR技术，证明3D基因表达产物在细胞内可促进口蹄疫病毒基因组的复制。 相似文献
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柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆与表达 总被引：2，自引：2，他引：2
用PCR技术特异扩增了柔嫩史美耳球虫TA4抗原基因cDNA序列，克隆至质粒pMD18-T中，获得重组质粒pMD18-T-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及PCR确认正确后，将TA4基NcDNA目的片段亚克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36n中，电穿孔法转化乳酸乳球菌LM0230，获得重组质粒pMG36n-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确。获得TA4乳酸乳球菌表达株，经SDS—PAGE电泳分析，结果表明表达产物与预期大小的TA4蛋白分子量一致。 相似文献
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口蹄疫病毒非结构蛋白3B真核表达载体的构建及表达 总被引：6，自引：0，他引：6
设计、合成FMDV非结构蛋白3B基因的PCR引物，并在引物5’端和3’端分别加入含BamH I和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV基因组PNA为模板，利用RT—PCR技术扩增3B基因，得到的基因片段经BamH I/HindⅢ双酶切后与转座载体pFASTBAC HTa连接，转化宿主菌DH10BAC，在含庆大霉索、卡那霉索、X-gal、IPTC的LB平板上37℃培养24h，提取白色菌落，从中提取重组Bacmid 3B，与脂质体共同转染昆虫细胞8f9，得到重组杆状病毒，病毒经传代扩增后感染High5细胞，表达目的蛋白——FMDV非结构蛋白3B。SBS-PAGE及Westem Blot结果显示，本研究成功构建了Bacmid-3B重组表达载体，并在昆虫细胞中表达了NSP—3B蛋白，该表达产物可与MDV感染的猪、牛血清产生免疫反应。 相似文献