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1.
根据鸡传染性支气管炎病毒M41株的基因序列(GenBank:AY851295.1),设计特异性引物,利用RT-PCR方法扩增其S1基因,并将扩增产物克隆到杆状病毒转移质粒pFast-VSV-G-CMV中,获得重组质粒pFast-VSV-G-CMV-S1,进一步将该重组质粒转化到DH10Bac感受态细胞中,得到重组穿梭载体Bacm id-CMV-S1,再利用脂质体转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Ac-V-S1.间接免疫荧光试验表明,该重组杆状病毒可以转导哺乳动物细胞并表达S1蛋白. 相似文献
2.
研究了口蹄疫病毒(FMDV)VP31基因在昆虫细胞中的表达.结果表明:利用重组杆状病毒在昆虫细胞中成功表达了AsiaⅠ型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP31基因,目的基因经亚克隆插入到含有一段蜂毒溶血肽序列的转移载体pMelBac B中,构建出穿梭质粒pMel-VP31.将含有目的基因的穿梭载体与线性化的杆状病毒骨架共转染昆虫Sf9细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.重组病毒经扩增后感染Sf9细胞,用Western-blot和间接夹心ELISA检测,证实VP31蛋白获得了表达. 相似文献
3.
用RT-PCR方法扩增届猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A、D,将其亚克隆至供体质粒pFastBacl,得到重组转移质粒pFastBael-TS1,转化到Escherichia coli DH5α中,提取阳性克隆质粒再转化到含穿梭载体bacmid的E.coliDHl0Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,经PCR鉴定后再转染Sf9昆虫细胞,经空斑筛选得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-FS1,经1FA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,重组杆状病毒TS1蛋白(相对分子质量约43 000) 在Sf9昆虫细胞中得到表达. 相似文献
4.
通过设计特异引物,扩增获得口蹄疫病毒3ABC编码区的目的基因片段,将其用SalI和NcoI双酶切后,与经同样处理的带有一段信号肽序列的穿梭质粒pMelBac-B连接,经筛选、鉴定及DNA序列分析后,获得重组质粒pMel-3ABC.将重组质粒与线性化的杆状病毒骨架Bac-N-Blue共转染Sf9昆虫细胞,通过噬斑筛选和PCR鉴定,获得了含有目的基因的重组杆状病毒.用重组病毒感染Sf9昆虫细胞,通过间接ELISA方法,检测细胞培养基上清液中表达的口蹄疫病毒抗原.结果表明,口蹄疫病毒基因片段3ABC正确克隆到杆状病毒载体上,重组病毒可在昆虫细胞中表达目的蛋白. 相似文献
5.
PCR扩增猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白(Capsid)基因,鉴定后克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTM1中,获得重组转移载体pFastBac-Cap,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经转座作用,蓝白菌落筛选得到含cap基因的重组穿梭载体Bacmid-Cap,以脂质体介导的方法将重组穿梭载体转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒reBacCap,PCR能够扩增出相应大小的片段,间接免疫荧光分析表明,PCV2阳性血清能使reBac-Cap感染的Sf9昆虫细胞出现特异性绿色荧光,表明reBac-Cap在Sf9细胞中成功表达PCV2-Cap蛋白.动物试验表明该重组病毒对小鼠有一定的保护力. 相似文献
6.
采用异硫氰酸胍法提取禽流感病毒分离株的SPF鸡胚尿囊毒RNA,利用RT-PCR技术扩增出禽流感病毒HA基因的cDNA。将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis,筛选到重组质粒,测序正确后与线性化的杆状病毒DNA(Bac-NBlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rpBlueBacHisH9HA。提取重组病毒DNA,经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中,血凝实验、SDS-PAGE实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的Highfive细胞中获得了表达。 相似文献
7.
利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法（IFA）和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。 相似文献
8.
【目的】在Sf9昆虫细胞中表达H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)神经氨酸酶(NA)基因。【方法】用PCR方法克隆H5N1亚型AIVNA基因,定点插入到转移载体pFastBacHTb中,构建重组转移载体pFastBacHTb-NA。将其转化到含有AcBacmid和helper质粒的E.coliDH10B感受态细胞中,与AcBacmid重组,获得rAcBacmid-NA。提取重组的Bacmid,转染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,获得重组杆状病毒vAc-NA。将vAc-NA重新感染处于对数生长期的昆虫Sf9细胞,3~5 d后收集被感染细胞。取转染细胞、感染细胞、破碎感染细胞上清和破碎感染细胞沉淀进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。【结果】通过PCR成功地克隆了1 352 bp的H5N1亚型AIV不含信号肽序列的NA基因;pFastBacHTb-NA和rAcBacmid-NA构建成功。AIVNA基因在昆虫Sf9细胞内得到有效表达,表达产物分子质量约为52 ku,且具有免疫原性。【结论】H5N1亚型AIVNA基因在昆虫Sf9细胞中表达成功。 相似文献
9.
应用杆状病毒表达系统,将猪圆环病毒2型 ORF2 基因插入供体质粒pFastBacTMDual pH启动子控制下的多克隆位点,引入EGT信号肽取代 ORF2 原有核定位信号肽以实现在昆虫细胞中分泌型表达,并在C端融合6个组氨酸标签以便于后期的纯化.将构建质粒转化DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭载体,提取重组Bacmid质粒.将阳性重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞,72 h收集培养上清液获得重组杆状病毒.间接免疫荧光试验和Western-blot表明,该重组杆状病毒可以在昆虫细胞实现猪圆环病毒2型Cap蛋白的分泌表达. 相似文献
10.
采用PT-PCR扩增Pyk2-kinase基因,定向克隆至转移载体pFastBac HTB,转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,转座后利用抗性及蓝白斑筛选阳性克隆获得重组Bacmid/Pyk2-kinase;提取重组杆粒,PCR法鉴定后转染昆虫细胞Sf9包装重组杆状病毒;利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot检测表达情况。最终获得了重组杆状病毒rBac-Pyk2-kinase,实现了Pyk2-kinase在Sf9细胞中的重组表达,其相对分子质量为32 ku,IFA、SDS-PAGE和Western blot检测结果与预期一致。 相似文献
11.
利用PCR方法扩增日本乙型脑炎病毒(JEV)E全长基因,然后将其克隆到杆状病毒转座载体pBac-SC中,筛选重组质粒pBacSC-E,再转化入含有穿梭载体的感受态细胞DH10Bac,经抗性及蓝白斑筛选得到含E基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组杆状病毒DNA转染Sf9昆虫细胞,从而获得重组杆状病毒。用此重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,经Western-blot检测表明,E基因在昆虫细胞中获得表达,表达蛋白的分子量约53 ku,与预期结果大小一致,且能与日本乙型脑炎阳性血清发生特异性反应,这为进一步研究JEV亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。 相似文献
12.
鸡传染性支气管炎病毒S1基因的真核表达及其产物的免疫原性 总被引：4，自引：0，他引：4
采用RT-PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒(IBV)M 41株的全长S1基因,并将其片段连接到pGEM-T载体,经酶切、PCR及序列测定表明,获得的S1基因ORF全长为1 659 bp,与G enB ank上公布的IBV M 41 S1基因序列一致。将S1基因与真核表达质粒pVAX 1连接,构建重组真核表达质粒pVAX 1-S1。将重组质粒转染COS-7细胞,采用间接免疫荧光检测转染细胞S1蛋白的表达。同时以重组质粒免疫小鼠,可诱导产生特异性针对IBV S1蛋白的抗体(P<0.01)。这为鸡传染性支气管炎新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
13.
CHEN Hong-ying ZHANG Hong-ying HUANG Yan-quan CUI Bao-an WANG Zhen-ya WANG Yan-bin LIU Jin-peng CHAO An-jun 《中国农业科学(英文版)》2010,9(8):1211-1220
Mature porcine interleukin-2 （pIL-2） gene was amplified by PCR from the plasmid pGEM-T-pIL2 and cloned into the baculovirus pFastBacTM Dual vector of the Bac-to-Bac baculovirus expression system under the control of the PH promoter. Recombinant plL-2 （rpIL-2） expressed in Sf9 insect cells was detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and immunofluorescence assay. Western blot analysis confirmed that the rpIL-2 protein had a molecular mass of 20 kDa, which was larger than the molecular mass of the mature protein predicted based on its peptide sequence. The rpIL-2 protein induced in vitro proliferation of ConA-stimulated porcine splenocytes and enhanced in vivo protective immune responses induced by vaccinating the pigs with inactivated oil emulsion vaccine against swine influenza virus. The results showed that the rpIL-2 expressed in Sf9 insect cells has immunoenhancement effects; the finding lays the foundation for the preparation of a specific recombinant IL-2 protein and the development of a novel immune adjuvant of vaccines against various infectious porcine pathogens to increase the immunoprotective efficacy of vaccines. 相似文献
14.
禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
15.
利用杆状病毒表达系统对ⅦNDV HN基因进行表达研究。RT-PCR扩增HN基因,将其克隆到p Fast Bac HT A载体中,阳性重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,PCR鉴定获得阳性克隆,碱裂解法提取阳性质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得含HN基因的重组杆状病毒质粒,重组病毒感染Sf9细胞72 h后,进行SDS-PAGE电泳、间接免疫荧光和Western-blot试验。免疫SPF鸡,间接ELISA测定抗体滴度,攻毒保护试验检测重组HN蛋白保护性。结果显示,目的蛋白HN在昆虫细胞中有特异性表达,该蛋白诱导了高滴度的NDV特异性抗体,具有良好的免疫原性;强毒攻击保护率达到75%,与La sota疫苗组保护率接近,均明显高于阴性对照组。上述结果为NDV新型亚单位疫苗奠定了基础。 相似文献
16.
鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及生物活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]研究鸡传染性支气管炎病毒S1基因的原核表达及反应原性鉴定。[方法]将S1基因克隆到pMD18-T质粒载体上构建pMD18-T-IBV-S1载体;将目的基因插入原核表达载体pET-32a（＋）的多克隆位点区,并将构建的重组质粒转化至宿主菌BL21中;IPTG诱导后的蛋白做SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析。[结果]S1基因在大肠杆菌中成功地进行了表达,表达的融合蛋白约为66kD,以包涵体形式存在。免疫印迹试验显示,重组蛋白可被IBV多克隆抗体识别。[结论]S1重组蛋白具有反应原性,为进一步研究IBV的新型疫苗奠定了基础。 相似文献