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1.
《蚕业科学》2017,(1)
选择家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白质谱数据库中新发现的假定表面蛋白NBO_33g0013进行研究,了解该蛋白质的功能及是否参与微孢子虫对宿主细胞的侵染过程。预测该蛋白质分子质量为26.1 k D,等电点为4.59,其序列N端具有信号肽,无跨膜螺旋结构,含3个N-糖基化位点,无O-糖基化位点,不具有典型的功能结构域,与柑橘凤蝶微孢子虫(Papilio xuthus)的一个假定蛋白序列相似度达到93%。以家蚕微孢子虫CQ1分离株的基因组DNA为模板克隆该蛋白质的编码基因,构建重组表达载体进行该蛋白质的原核表达,并制备获得多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析确证该蛋白质定位在家蚕微孢子虫孢子表面。经体外细胞感染实验初步分析,尚未发现该蛋白质参与了微孢子虫孢子对宿主Bm E细胞的粘附过程,推测该蛋白质可能为家蚕微孢子虫孢壁的结构组成型蛋白质,在孢壁的构架形成中发挥作用。 相似文献
2.
层粘连蛋白是重要的细胞外基质成分之一,在基膜的构建及细胞的黏附等方面都有重要作用。通过检索微孢子虫数据库发现家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)存在假定层粘连蛋白基因Nb HLAMB4,根据该基因序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆了Nb HLAMB4基因。该基因的开放阅读框(ORF)全长为1 104 bp,预测编码的蛋白质含有367个氨基酸,分子质量为43.74 k D,等电点为5.72。Nb HLAMB4蛋白序列含有一个N-糖基化位点和Pfam:SAS-6_N结构域,无信号肽,也无跨膜结构域。应用酵母双杂交技术,以Nb HLAMB4作为诱饵蛋白,通过筛选家蚕中肠c DNA文库,初步得到3个与Nb HLAMB4互作的候选蛋白质,分别是家蚕热休克蛋白(Hsp40)、锌指蛋白420类似物(similar to zinc finger protein 420)、氨肽酶N(aminopeptidase N)。研究结果为阐明家蚕微孢子虫的侵染机制提供了新的线索。 相似文献
3.
BmLSP基因启动子驱动DsRed在转基因家蚕中的表达分析 总被引：1，自引：0，他引：1
家蚕幼虫血清蛋白(BmLSP)是由脂肪体细胞合成的一种贮藏蛋白,是研究家蚕幼虫期发育调控的理想靶标。基于家蚕基因组数据,克隆了BmLSP基因5'端侧翼区～1.6 kb的调控序列,构建成以红色荧光蛋白基因DsRed为报告基因的pig-gyBac表达载体并进行转基因注射,在个体水平上验证该启动子的特性。结果表明:BmLSP-DsRed表达框以单拷贝形式整合至家蚕基因组;DsRed在转基因家蚕脂肪体中特异转录表达,其时期表达特征与BmLSP基因基本一致,随发育阶段的不同呈现有规律的变化,即幼虫期表达,但1龄、2龄眠期不表达,3龄、4龄眠期有微弱表达,上蔟后表达量逐渐降低直至化蛾阶段消失。提示BmLSP可能通过其启动子区的特异元件受激素的精确调控而行使功能。 相似文献
4.
细菌人工染色体(BAC)文库是进行生物基因组学研究的一个重要手段。以家蚕微孢子虫(Nosema bomby-cis)重庆分离株为材料,在前期构建的家蚕微孢子虫基因组框架图数据基础上,对构建家蚕微孢子虫BAC文库过程中的关键技术,如脉冲胶块(plug)的制备与处理、限制性酶的筛选、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入DNA片段与载体的摩尔比值等进行了研究,建立了构建家蚕微孢子虫BAC文库适宜的技术体系。构建的家蚕微孢子虫BAC文库由6 478个克隆构成,克隆片段平均大小约为50 kb,相当于家蚕微孢子虫基因组(15.33 Mb)的20倍,文库空载率较低,有利于深入开展家蚕微孢子虫基因组相关方面的研究。 相似文献
5.
半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。 相似文献
6.
烯醇化酶(enolase,ENO)是糖酵解途径的限速酶,对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)烯醇化酶的研究有助于了解微孢子虫的能量代谢机制。依据微孢子虫基因组数据库中的家蚕微孢子虫烯醇化酶编码序列设计引物,以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得家蚕微孢子虫烯醇化酶基因(Nb ENO)。该基因ORF全长1 242 bp,编码413个氨基酸,预测蛋白质分子质量46.323 k D,等电点6.13;蛋白质二级结构主要由α螺旋(28.33%)、延伸片段(22.52%)和无规则卷曲(49.15%)组成,含有25个磷酸化位点和1个糖基化位点,无信号肽和跨膜结构域。系统进化树分析Nb ENO与蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)烯醇化酶基因序列(Nc ENO)的亲缘关系较近,序列比对显示二者的一致性为62.10%。将Nb ENO基因插入原核表达载体p ET-28a并转化大肠埃希菌Rosatta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后获得预期大小约50 k D的重组Nb ENO蛋白,有利于进一步研究Nb ENO的功能及亚细胞定位。 相似文献
7.
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)是戊糖磷酸途径的限速酶,参与生物体内递氢体NADPH的产生。通过检索微孢子虫数据库获得家蚕微孢子虫6PGDH基因序列,以家蚕微孢子虫镇江株基因组为模板,设计特异性引物成功克隆了该基因,命名为Nb6PGDH,并对该基因进行序列特征和表达特征分析,为了解6PGDH基因在微孢子虫生长发育过程中的功能提供有用信息。克隆得到的序列全长1 374 bp,包含一个完整的ORF,编码457个氨基酸;与Gen Bank数据库中家蚕微孢子虫6PGDH基因长度相同,相似度为99. 42%,其中8个碱基存在差异,编码的3个氨基酸发生改变。生物信息学分析表明Nb6PGDH蛋白没有信号肽,无跨膜结构域,分子质量为51. 8 k D,等电点5. 83,存在38个磷酸化位点和2个N-糖基化位点。实时荧光定量PCR分析结果表明,家蚕微孢子虫感染家蚕后2~168 h,中肠组织中Nb6PGDH基因都有所表达,且表达水平在生长发育过程中发生变化,说明Nb6PGDH基因在家蚕微孢子虫增殖发育过程中具有一定的生理功能。 相似文献
8.
利用PCR方法从猪基因组DNA中扩增了1.2 kb的肌肉生长抑制素(myostatin)基因启动子序列。并进一步以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建了真核表达载体MSTNPro-EGFP;通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞和猪成纤维细胞,对猪myostatin基因启动子的转录调控活性进行鉴定。结果表明:猪myostatin基因启动子可以启动GFP在C2C12细胞中的转录和表达,而将猪MSTNPro-EGFP载体转染猪胎儿成纤维细胞后并未观察到GFP的表达,说明myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性。 相似文献
9.
基于家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)基因组中发现的蓖麻毒素B链(ricin B chain)序列数据设计引物,提取感染Nb第8天的家蚕幼虫中肠组织总RNA,利用RT-PCR方法扩增出RBL463-4基因,并将其克隆进毕赤酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组酵母表达载体pPIC-R4。重组质粒pPIC-R4经SacⅠ线性化后,电击导入毕赤酵母X33中,利用博莱霉素(zeocin)筛选获得重组酵母X33/RBL463-4。以2%甲醇诱导表达后,经SDS-PAGE、Western blot检测表达产物,结果出现25kD和20kD2种蛋白,其中25kD蛋白与预测融合蛋白大小一致,表明获得了RBL463-4的融合蛋白。研究结果为进一步探究RBL463-4蛋白在家蚕微孢子虫侵染宿主过程中的功能作用奠定了基础。 相似文献
10.
《广西蚕业》2019,(2)
家蚕Bmtutl-519蛋白是家蚕Turtle蛋白的一个亚型,属于免疫球蛋白超家族。在家蚕微孢子虫感染BmN细胞后,Bmtutl-519的相对表达水平明显上调。在BmN细胞中,通过间接免疫荧光分析(indirect immunoinfluscent assay,IFA)、共定位实验、蛋白印迹法以及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合载体转染Bmtutl-519表达质粒来研究Bmtutl-519的亚细胞定位。结果表明,Bmtutl-519在BmN细胞的细胞质和细胞膜中均有分布。Bmtutl-519可能作为细胞表面受体或调控因子参与了家蚕微孢子虫的感染过程。Bmtutl-519与家蚕微孢子虫壁蛋白NbSWP26(参与宿主细胞粘附和感染过程)的相互作用分析表明,NbSWP26的C端肝素结合基序(heparin-binding motif,HBM)介导了这两种蛋白之间的相互作用。在将NbSWP26的赖氨酸突变为甘氨酸(K208G、K209G、K210G和K213G)的突变型中,NbSWP26蛋白中HBM的突变导致其结合Bmtutl-519蛋白的能力丧失。微孢子虫粘附和感染试验表明,Bmtutl-519增强了家蚕微孢子虫与宿主细胞表面的结合能力,但并没有增强家蚕微孢子虫对宿主细胞的感染能力。相反,在BmN细胞中,Bmtutl-519的持续高表达抑制了家蚕微孢子虫的增殖。 相似文献
11.
家蚕微孢子虫全基因组分析支持微孢子虫与真菌的亲缘关系 总被引：1，自引：1，他引：0
微孢子虫(microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,虽然分子生物学的研究证据表明其与真菌(fun-gi)存在亲缘关系,但这些证据均是基于单个或少数几个基因构建系统进化树而得出的。利用家蚕微孢子虫全基因组数据,采用基于基因同源性的Darkhorse基因组统计方法,鉴定家蚕微孢子虫基因组中每个基因的来源谱系,并通过全基因组谱系可能性指数(lineage probability index,LPI)分析微孢子虫与其他物种的亲缘关系。结果表明家蚕微孢子虫与其他微孢子虫的LPI加权平均值为0.93,具有最近的亲缘关系,与真菌界的LPI加权平均值为0.65,与原生生物界的LPI加权平均值为0.38。由此证明微孢子虫与真菌存在着更近的亲缘关系,微孢子虫门属于真菌界而非原生生物界。 相似文献
12.
重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析 总被引：1，自引：1，他引：0
用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。 相似文献
13.
试验探讨了微孢子虫的交叉感染性与孢子表面蛋白的变化。结果表明,家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)转主感染桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)后孢子形态变为细长,分离纯化感染前和感染后的孢子表面蛋白,通过SDS-PAGE电泳发现形态变异株出现了34 kD和67 kD的差异带,在相同条带17、30、47、77和114 kD表达量存在明显的差异,但33 kD和43 kD条带表达量没有差异。孢子表面蛋白的差异性表达可能与微孢子虫感染适应性有关,而33 kD和43 kD可能是微孢子虫共有的保守蛋白。 相似文献
14.
糖蛋白在免疫识别、信号转导等生命进程中扮演重要角色。为研究微孢子虫糖蛋白及其糖基化类型,采用比较基因组学方法对微孢子虫O-甘露糖糖基化通路进行分析。真核生物的O-甘露糖糖基化通路中有6种主要酶类,包括己糖激酶、磷酸甘露糖酶、GDP甘露糖磷酸化酶、Dol-P甘露糖合成酶、甘露糖转移酶、Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶。通过生物信息学方法分析家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)、蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(Encephalitozoon intestinalis)、比氏肠道微孢子虫(Encephalitozoon bieneusi)和柞蚕微孢子虫(Nosema antheraea)的这6种酶基因编码氨基酸序列特征及结构域类型,发现这些酶的垂直同源基因比较保守,多重序列比对表明在6种微孢子虫之间,6种酶的氨基酸序列相似性比较高,系统进化分析显示同属的微孢子虫多聚为一簇。研究结果表明,N.bombycis、N.ceranae、E.cuniculi、E.intestinalis和N.antheraea 5种微孢子虫的O-甘露糖糖基化的蛋白质修饰通路是完整、保守的,然而在E.bieneusi中,其关键酶Dol-P甘露糖蛋白甘露糖转移酶的氨基酸序列比较短,只有342个氨基酸,缺失了关键结构域PMT,因此可能无法完成O-甘露糖糖基化修饰。以上微孢子虫的O-甘露糖糖基化通路中6种主要酶的序列信息,为后续解析家蚕微孢子虫糖基化通路及对糖蛋白糖基化类型与功能的研究提供了线索。 相似文献
15.
为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵母CEN.PK2中,经尿嘧啶缺陷型营养筛选,获得重组酵母pUG-gp5-gfp/CEN.PK2,在甲硫氨酸营养缺陷培养基诱导表达后,荧光显微镜观察显示,gp5-gfp融合基因在酿酒酵母中获得表达,所表达的融合荧光蛋白主要聚积位置与内质网和质膜的定位模式一致,表明GP5蛋白信号肽在酵母中起到了导向作用,揭示了PRRSV在宿主细胞中获得囊膜的可能位置。该研究为其他病毒在宿主细胞中的组装位置研究提供新的思路。 相似文献
16.
The swine leukocyte antigen (SLA) genes in pigs were the important immune gene group in antigen presentation, and studing on SLA could provide the references for the prevention of some infectious diseases. Earlier studies found that SLA-1-632-TPK gene in ToPigs pig had a deleted base in its coding sequence (a single base "C" was lost in 632 bp from the 5' end of the SLA-1-632-TPK gene), which lead to frameshift mutation. In order to correct the SLA-1-632-TPK gene, two pairs of gene-correction's primers were designed to correct the gene by the splicing overlap extension PCR (SOE-PCR) in template of recombinant plasmid of SLA-1-632-TPK/pMD18-T. Firstly,the 5'and 3'ends of SLA-1-632-TPK gene were amplified, respectively, then both of them were spliced and amplified to form an intact SLA-1-632-TPK gene. After detected by agarose electrophoresis, the interest of the product was further cloned into pMD19-T Simple vector. The positive clones were screened by colony PCR and then sequenced. The result showed that the 5'and 3' ends of the SLA-1-632-TPK gene were all amplified successfully by SOE-PCR, with the products of about 650 and 590 bp, which were consistent with the theoretical value of 648 and 585 bp, respectively. After spliced, the intact sequence of SLA-1-632-TPK gene was obtained with the product of about 1 200 bp, which was close to the theoretical value of 1 223 bp. The colony PCR result showed that the corrected gene was successfully inserted into pMD19-T Simple vector . After the sequence was analyzed by GENETYX version 9.0, it was shown that the nucleotide "C" in 632 bp numbered from the 5'end of the gene was added and the SLA-1-632-TPK gene was coded correctly. In this study, the SLA-1-632-TPK was corrected successfully, and the recombinant plasmid SLA-1-TPK/pMD19-T was constructed, which would lay a foundation to further study the protein expression and associated function of SLA-1-TPK. 相似文献
17.
猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen,SLA）在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失（距离SLA-1-632-TPK基因5'端632 bp处丢失1个碱基"C"）,导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR（splicing overlap extention PCR,SOE-PCR）技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5'和3'端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5'和3'端片段,大小约为650和590 bp,与理论设计值大小（648和585 bp）接近,经过拼接以后,得到全长约1 200 bp,与理论设计值1 223 bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5'端632 bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。 相似文献
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利用RT-PCR技术对番鸭源新城疫病毒FP1/02株的F蛋白基因进行分段扩增、定向克隆到pMD 18-T Simple Vector质粒载体，然后制定其核苷酸序列，拼接出F基因全序列．并推导出其相应的氨基酸序列。FP1／02株的F蛋白基因全长1690bp．编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为^112R-R-Q-K-R-F^112．具有强毒蛛特有的氨基酸序列结构特征。核苷酸序列分析结果表明，FP1／02株与其他不同源新城疫病毒毒株之间的核苷酸序列同源性为87.2%～93.3%. 相似文献
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家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究 总被引：16，自引：6，他引：10
在ＤＮＡ水平上，以聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｏｎ，ＰＣＲ）技术检测家蚕微孢子虫的结果。设计、合成了两对引物，其中引物Ⅰ是针对家蚕微泡子虫（ＮｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓＮ．ｂ．）引物Ⅱ是针对变形孢子虫（ＶａｉｒｉｍｏｒｐｈａｎｅｃａｔｒｉｘＶ．ｎ，）的。用这两对引物分别对“桑尺蠖微孢子虫”孢子ＤＮＡ和Ｎ．ｂ．（镇江株）的纯孢子及其感染的幼虫、蛹及蛾的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，均获得预期的阳性条带；对不同引物扩增的产物进行了ＤＮＡ序列分析。初步认为引物Ⅰ可作为家蚕微孢子虫Ｎ．ｂ．特异性较高的检测引物，而引物１是微孢子虫共有的检测引物。进一步讨论了对家蚕微孢子的检测及分类上的问题。 相似文献
20.
家蚕几种病原微孢子虫的比较研究 总被引：7，自引：4，他引：3
从不同地区养蚕生产及桑园害虫中分别收集到四种微孢子虫，ＭＡ—１、ＭＤ—１、Ｐｈａ—Ｍ和Ｈａ—Ｍ。从它们孢子的形态、对蚕的致病性、相互间的血清学关系、在蚕体内的寄生部位和引起的组织与细胞病变以及在蚕体内增殖的生活史等方面与典型的家蚕微粒子病病原Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ进行了比较研究。结果表明，ＭＡ—１与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ相同；Ｈａ—Ｍ可能亦来源于Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ；ＭＤ—１为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ的形态变异株，定名为Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓｍｏｒ．ｖａｒ．；而Ｐｈａ—Ｍ为与Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ不同的种，暂称为Ｎｏｓｅｍａｓｐ。 相似文献