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1.
猪白细胞抗原（swine leukocyte antigen,SLA）在猪免疫系统中起递呈抗原作用,对其展开研究可为猪相关传染病的预防提供依据。研究发现,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因编码序列发生碱基缺失（距离SLA-1-632-TPK基因5'端632 bp处丢失1个碱基"C"）,导致移码突变。为矫正SLA-1-632-TPK基因,设计2对矫正引物,以原重组质粒SLA-1-632-TPK/pMD18-T为模板,利用剪切重叠延伸PCR（splicing overlap extention PCR,SOE-PCR）技术分别扩增SLA-1-632-TPK 5'和3'端,之后进行拼接,最后扩增全序列从而矫正目的基因,并进一步连接pMD19-T Simple载体,通过单菌落PCR筛选阳性克隆并测序,并通过GENETYX version 9.0软件对所测序列进行分析。结果显示,SOE-PCR成功扩增得到5'和3'端片段,大小约为650和590 bp,与理论设计值大小（648和585 bp）接近,经过拼接以后,得到全长约1 200 bp,与理论设计值1 223 bp接近。菌落PCR结果显示,矫正基因成功克隆入pMD19-T Simple载体。序列分析结果显示,托佩克猪SLA-1-632-TPK基因距离5'端632 bp处丢失的碱基"C"得到矫正并正确编码。本研究成功矫正了SLA-1-632-TPK基因,并构建其重组质粒SLA-1-TPK/pMD19-T,为下一步研究SLA-1-TPK蛋白表达和相关功能奠定基础。 相似文献
2.
为构建大约克猪SLA-1胞外区的原核表达载体及表达目的蛋白,试验设计1对引物,经PCR扩增获得大约克猪SLA-1胞外区基因（命名为SLA-1-DYKe）,将此片段克隆至pMD®19-T Simple Vector,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选阳性克隆菌并测序,将目的基因插入到原核表达载体pET-28a（+）中,转化至宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达,用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况,大量诱导提取包涵体并检测。结果显示,PCR成功扩增SLA-1-DYKe的胞外区,得到大小为837 bp的目的基因,目的基因成功克隆至pMD®19-T Simple Vector,并获得序列正确的重组质粒。以得到的重组质粒成功构建了SLA-1-DYKe/pET-28a（+）表达载体,目的蛋白大小约为34 ku。本研究成功构建了大约克猪SLA-1原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后研究大约克猪SLA-1的空间结构和基因功能奠定了基础。 相似文献
3.
In order to construct the prokaryotic expressing vector of SLA-1 derived form Yorkshire pig and express the interest of protein, a pair of primers was designed to amplify the extracellular domain of SLA-1 gene from Yorkshire pig (named SLA-1-DYKe) by PCR. Then the PCR product was cloned into pMD®19-T Simple Vector and transformed into Escherichia coli TOP10. After cleaved by Nde Ⅰ and Xho Ⅰ, the positive clones were selected to be sequenced. Analyzing by biological soft, the fragment from positive clone with correct sequence was inserted into pET-28a (+) and transformed into E.coli BL21(DE3). After induction and expression, the interest of protein was detected by SDS-PAGE. The results showed that the extracellular domain of SLA-1-DYKe was successfully amplified with the fragment length of 837 bp. The interest of SLA-1 gene was successfully cloned into pMD®19-T Simple Vector and the positive recombinant plasmids with correct sequences were obtained. The SLA-1-DYKe from positive recombinant plasmids was further inserted into pET-28a(+). After transformed into E.coli BL21(DE3) and induction, the SLA-1-DYKe was successfully expressed. The molecular weight of the protein was about 34 ku. It was concluded that the prokaryotic expressing vector of SLA-1 was constructed successfully from Yorkshire pigs and then the expressed protein was obtained, which would lay a base for studying on the structure and function of SLA-1 from Yorkshire pig in the future. 相似文献
4.
中国2个地方品系猪SLA-3原核表达载体构建及表达 总被引：2，自引：1，他引：1
为构建中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3(命名为SLA-3-HB和SLA-3-LW)原核表达载体及表达目的蛋白,试验通过PCR扩增获得SLA-3胞外区基因,并克隆至pMD19-T Simple载体,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,酶切及测序筛选阳性重组质粒;重组质粒经酶切回收,目的片段进一步连接pET-21a(+)表达载体,并转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导目的基因的表达;SDS-PAGE检测目的蛋白。结果显示,PCR成功扩增SLA-3-HB及SLA-3-LW胞外区,大小约850 bp,目的基因成功克隆至pMD19-T Simple载体,并筛选序列正确的阳性重组质粒。进一步研究证实,SLA-3-HB及SLA-3-LW成功连接到表达载体pET-21a(+),插入片段长度均为831 bp。经诱导后,SLA-3-HB及SLA-3-LW均成功表达,表达蛋白大小为31 ku,相对表达含量达到40%。本研究成功构建了中国地方品系荷包猪及莱芜黑猪SLA-3原核表达载体,为进一步研究其结构和功能奠定基础。 相似文献
5.
为构建烟台黑猪SLA-2-YTH基因原核表达载体,本研究设计引物PCR扩增SLA-2-YTH胞外区,将其克隆至pMD 19-T Simple 载体,筛选阳性克隆。阳性克隆经酶切后,进一步与表达载体pET-28a(+)连接,转化BL21（Rosseta）感受态细胞并进行诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果显示,SLA-2-YTH胞外区亚克隆大小为834 bp,酶切鉴定证实其成功插入pET-28a（+）表达载体。SDS-PAGE结果显示,SLA-2-YTH基因导入宿主菌后成功表达,蛋白大小约31.0 ku,与预期结果相符,优化后蛋白相对表达量达25%以上。本研究成功构建了烟台黑猪SLA-2-YTH原核表达载体,获得了表达蛋白,为今后进一步的结构和功能研究奠定基础。 相似文献
6.
为了构建荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链原核表达载体,并获得SLA-3-HB01表达蛋白,试验以SLA-3-HB01/pMD18-T为模板进行PCR扩增四聚体前体链SLA-3-HB01-BSP,并克隆至pMD19-T载体中,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切筛选阳性克隆并测序,目的基因连接至表达载体pET-21a（+）,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小及表达情况,提取包涵体并进行检测。结果显示,PCR成功扩增得到SLA-3-HB01-BSP,大小为896 bp左右。酶切鉴定证实,目的基因成功克隆至pMD19-T载体中,插入片段大小为876 bp,阳性克隆经测序后所获序列与原序列一致,并在3'端带有BSP标签序列。酶切鉴定进一步证实成功构建SLA-3-HB01-BSP/pET-21a（+）重组表达载体,经转化及诱导表达,SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子质量在33.5 ku左右。包涵体蛋白分子质量约33.5 ku,与菌体中目的蛋白大小一致,经凝胶成像系统UVP扫描分析,包涵体蛋白纯度接近于90%,符合进行相关结构和功能研究的要求。本研究成功构建了荷包猪SLA-3-HB01基因四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达系统,并获得了一定纯度的包涵体蛋白。 相似文献
7.
【目的】 利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】 提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用DNAMAN 5.2.2、Mega 5.0、Multalin及同源建模进行系统进化树、二级结构、三级结构分析。【结果】 RT-PCR扩增获得约1 400 bp条带,质粒提取和酶切鉴定结果表明SLA-1成功插入pMD18-T载体;测序结果证实该基因共1 419 bp,其中2－1 087 bp为编码区,共编码361个氨基酸,信号肽为21个氨基酸,符合SLA-1基因特征。进化树分析结果显示,SLA-1*PK15与SLA-1*wxd(中国梅山猪)和SLA-1*0401(中国巴马小型猪)进化关系最近,而与SLA-1*lr02(丹麦长白猪)及SLA-1*0509(中国西藏野猪)进化关系较远。胞外区氨基酸比较分析表明,PK15细胞SLA-1基因与其他SLA-1基因胞外区主要变异位点存在于α1区和α2区,α3区的变异位点较少,无特征性氨基酸变异位点。PK15细胞SLA-1蛋白的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主。同源建模结果显示,SLA-1蛋白具有SLA class Ⅰ典型的三级结构,α1区和α2区构成抗原多肽结合区。【结论】 SLA-1基因稳定存在于PK15细胞,PK15细胞具有作为SLA-1抗原表位筛选系统的潜在应用价值。 相似文献
8.
To construct tetramer precursor chain of swine lymphocyte antigen 1 (SLA-1) heavy chain in Hebao pig and study its protein expression in the pET-21a (+) vector,the SLA-1 complete genome sequence was referenced with the characteristics of the expression vector,and a pair of primers was designed to integrate the BirA substrate peptide (BSP) sequence at the C-terminus of the SLA-1-HB01 and the SLA-1-HB01-BSP was amplified by PCR. Then,the products were cloned into the pEASY T1 vector and the positive clones of SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1 was selected. After the double digestion,the interest of the gene in positive clone was further ligated into the pET-21a (+) expression vector and transformed into E.coli BL21 to construct the recombinant strain of pET-21a (+)/SLA-1-HB01-BSP. After induction with IPTG,the target protein were detected by SDS-PAGE. Finally,the inclusion body of the SLA-1-HB01-BSP was isolated and detected to evaluate its purity. The PCR results showed that the length of SLA-1-HB01-BSP was about 898 bp,which was consistent with the theoretical value. The amplified fragment was successfully cloned into pEASY T1 vector, and the positive clones were identified by Nde Ⅰ and Xho Ⅰ digestion. The size of inserted fragment was 876 bp. The interest of gene was also inserted into pET-21a (+) and transformed into E.coil BL21 successfully. After induction,SDS-PAGE detection results showed that the target protein was 31.4 ku. Further detection showed that the target protein was mainly expressed as inclusion bodies,and the purity of the protein was about 80%. In this study,the recombinant tetramer precursor of SLA-1-HB01 heavy chain was constructed in pET-21a (+) expression line successfully, which would lay a foundation to detect the tetramer of SLA class Ⅰ molecular. 相似文献
9.
试验旨在构建荷包猪猪白细胞抗原1（swine lymphocyte antigen 1,SLA-1）重链四聚体前体链并研究其在表达载体pET-21a（+）中蛋白的表达情况。以SLA-1全基因序列为模板,结合表达载体的特点设计引物,利用PCR扩增技术在SLA-1-HB01胞外区序列C-末端加载上可生物素酰化序列（BirA substrate peptide,BSP）。将PCR扩增产物SLA-1-HB01-BSP克隆到pEASY T1载体上,筛选出阳性克隆菌SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,经双酶切后进一步与表达载体pET-21a（+）连接,再转化到E.coli BL21感受态细胞中构建pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,通过IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE检测蛋白的大小及表达情况,提取包涵体检测蛋白的纯度。PCR扩增结果显示,SLA-1-HB01-BSP大小为898 bp,与理论值相符,扩增片段成功克隆至pEASY T1载体构建克隆菌,经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切筛选及测序,成功获得阳性克隆菌株SLA-1-HB01-BSP/pEASY T1,插入的目的基因片段大小为876 bp。阳性克隆菌株与pET-21a（+）表达载体经Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后进行连接,转化E coli BL21感受态细胞后获得pET-21a（+）/SLA-1-HB01-BSP重组表达菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白大小为31.4 ku。进一步检测分析发现,目的蛋白以包涵体形式存在,且蛋白纯度达到80%以上。本研究成功构建了荷包猪SLA-1-HB01重链四聚体前体链的pET-21a（+）重组表达体系,为下一步进行猪SLA Ⅰ类分子四聚体的检测奠定基础。 相似文献
10.
鸡传染性贫血病毒VP1和VP2基因共表达载体的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
根据GenBank中收录的鸡传染性贫血病毒(CIAV)基因组序列,设计了扩增CIAV VP1和VP2基因的特异性引物,运用PCR技术从发病鸡肝组织DNA中扩增得到VP1、VP2基因,并将其克隆至pMD18-T载体.核苷酸测序结果显示,其序列与发表的序列同源性达到99.8%.将VP2基因克隆到pMD18-T载体,并对Vp3基因起始密码子进行定点突变,得到突变基因mVP2.将mVP2、VP1先后克隆至pIRES载体,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定显示,成功获得了共表达质粒pIRES-VP1/mVP2. 相似文献
11.
为研究斯氏副柔线虫(Parabronema skrjabini)种间遗传标记特点,从内蒙古地区骆驼皱胃中采集斯氏副柔线虫成虫,提取虫体DNA,利用线虫通用引物扩增细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到pMD19-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落并进行测序,运用DNAStar 5.0和MEGA 4.0软件将测序结果与GenBank公布的相关线虫CO1序列进行比对分析。结果显示:斯氏副柔线虫DNA扩增出的CO1基因序列片段长度为689 bp。同其他相关属线虫CO1基因序列比对,斯氏副柔线虫与小口柔线虫(Habronema microstoma)、蝇柔线虫(Habronema muscae)的同源性最高,为86.7%,遗传距离为0.143;与加利西亚光丝虫(Litomosoides galizai)的同源性最低,为80.1%,遗传距离为0.229。通过两种不同方法建立的系统发育树比较,证实斯氏副柔线虫与柔线属线虫均位于同一分支,自展值都在47%以上。表明CO1基因不仅可以作为斯氏副柔线虫理想的种间遗传标记,也可为该线虫进一步的分子分类学研究提供重要基础。 相似文献
12.
采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。 相似文献
13.
为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。 相似文献
14.
绵羊FecB基因打靶载体构建 总被引：1，自引：0，他引：1
利用peGFP-C1,pRET.IL.PGK-TK和pMD19-T Simple等基本质粒,构建绵羊FecB基因打靶载体。以克隆载体pMD19-T Simple为载体骨架,插入一个正选择标记eGFP基因、一个负选择标记基因HSV-tk基因,并在eGFP基因两侧各添加一个同源长臂和同源短臂,从而构建绵羊FecB基因打靶载体。结果:经多个限制性内切核酸酶酶切鉴定和测序证实,所构建的基因打靶载体符合设计要求,表明成功构建了绵羊FecB基因打靶载体。 相似文献
15.
参照GenBank公布的仅有的日本株猪细胞巨化病毒较大衣壳蛋白（MCP）基因序列（登录号：AB051069）设计2对引物,采用分步克隆的方法,将PCMVMCP全序列克隆入pMD19-T载体进行测序,成功获得了pMD-MCP重组质粒,将所得序列录入到GenBank中（登录号：HQ025802）。测序结果表明,该MCP基因全长4017bp,共编码1338个氨基酸;与NCBI上公布的仅有的日本毒株MCP基因的核苷酸同源性为96．8％,氨基酸同源性为94．1％;进化分析显示：PCMVMCP基因与人疱疹病毒6型或7型的MCP基因亲缘关系较近;利用生物信息学软件对蛋白质结构特征进行分析,发现该蛋白含有59个潜在的磷酸化位点,潜在功能强大;亚细胞定位预测结果表明该蛋白主要存在于线粒体中和细胞质中并各占39．1％和26．1％,内质网占17．4％,高尔基体占8．7％,空泡和细胞核均占4．3％,表明PCMVMCP蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞质移动的趋势;另该成熟蛋白存在18个主要的抗原位点,将肽链经亲水性与抗原表位的共同分析,发现其肽链的c端极有可能分布有抗原决定簇。 相似文献
16.
本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。 相似文献
17.
参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型菌株,设计1对特异性引物,PCR扩增转铁结合蛋白B(tbpB)全基因,克隆到pMD19-T Simple载体中,经测序比较,与参考序列的核苷酸同源性达99.72%。试验将tbpB基因定向克隆到pET-32a( )中,转化BL21(DE3),经诱导后,SDS-PAGE结果显示转铁结合蛋白B得到表达,Western blot检测呈阳性。 相似文献
18.
根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
19.
西门塔尔牛肌肉生成抑制素基因编码序列的克隆与序列分析 总被引：2，自引：0，他引：2
本研究根据Genbank中牛肌肉生成抑制素基因序列设计引物，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶BarnHI和EcoRI的识别位点序列。利用RT—PCR技术从西门塔尔牛肌肉组织的总RNA中扩增出MSTN基因的CDNA序列，扩增出1125bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致，表明成功地克隆了西门塔尔牛的肌肉生成抑制素基因的蛋白编码序列。 相似文献
20.
小花碱茅HKT1;4基因片段的克隆与序列分析 总被引：1，自引：1，他引：0
摘要：为研究小花碱茅(Puccinellia tenuiflora)拒Na+的分子机制,根据GenBank中已登录的植物HKT1;4基因保守序列设计一对简并引物,从小花碱茅幼根中提取总RNA,采用RT PCR方法扩增出HKT1;4基因片段并连接到pMD19 T Simple载体上,经亚克隆,PCR阳性检测后测序,得到一段长629 bp的序列。序列分析表明,该片段编码209个氨基酸,与GenBank中注册的高等植物HKT1;4基因核苷酸序列同源性在74%以上,与HKT1;4蛋白氨基酸序列同源性在60%以上,最后将其命名为PutHKT1;4。 相似文献