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1.
《南京农业大学学报》2016,(5)
[目的]本试验旨在研究猪卵母细胞成熟过程中细胞骨架的动态变化以及秋水仙碱对卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体的影响。[方法]采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微成像技术,检测微管蛋白(α-tubulin)等细胞骨架蛋白的表达与亚细胞定位,之后采用秋水仙碱处理猪卵母细胞,研究秋水仙碱对卵母细胞成熟及MⅠ期纺锤体结构的影响。[结果]猪卵母细胞α-tubulin在生发泡破裂(GVBD)之后开始组装,第一次减数分裂中期(MⅠ)形成典型的纺锤体结构,第一次减数分裂后期至末期(ATⅠ)则分布于两组染色体之间,第二次减数分裂中期(MⅡ)在染色体附近重新组装形成典型的纺锤体;微丝蛋白(F-actin)在GVBD之后富集在细胞外周皮质下区域,并分别于MⅠ期和MⅡ期在纺锤体紧邻的皮质区富集形成微丝帽。在此基础上,通过秋水仙碱处理MⅠ期卵母细胞后,第一极体(pbⅠ)排出率显著下降,且绝大多数卵母细胞纺锤体解聚,染色体排列紊乱;但秋水仙碱撤除后,微管蛋白可重新组成MⅠ期纺锤体结构,延长培养时间后,pbⅠ排出率恢复。[结论]猪卵母细胞成熟过程中细胞骨架的动态变化具有阶段性分布特点,秋水仙碱可以使猪卵母细胞MⅠ期纺缍体发生解聚,成熟受到抑制,但秋水仙碱对MⅠ期卵母细胞纺缍体结构及功能的影响在一定程度上具有可逆性。 相似文献
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[目的]本试验旨在探究Aurora-A抑制对猪卵母细胞成熟和纺锤体组装的影响及潜在机制。[方法]猪GV期卵母细胞分组进行体外成熟培养,在各组中分别添加0、1、3和5μmol·L~(-1)Aurora-A特异性抑制剂MLN8054,观察其对卵母细胞发育与成熟的影响及纺锤体结构的变化;免疫印迹检测磷酸化Aurora-A和TACC3的表达。[结果]Aurora-A抑制导致猪卵母细胞成熟明显受阻(P0.05),且主要阻滞在Pro-MⅠ期及MⅠ期;MⅠ期纺锤体形态明显异常,出现单极或多极纺锤体,异常率显著上升(P0.05)。Aurora-A抑制后,猪卵母细胞磷酸化Aurora-A和酸性卷曲转化相关蛋白3(TACC3)表达水平显著下降(P0.05)。[结论]MLN8054处理后,猪卵母细胞减数分裂进程和纺锤体组装受阻,并抑制了磷酸化Aurora-A和其下游蛋白磷酸化TACC3的表达。 相似文献
3.
SETD2是H3K36me3特异性甲基转移酶，参与组蛋白甲基化修饰，并通过调节多种基因的表达影响细胞功能。为探究SETD2在猪卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）过程中的表达规律及作用，通过免疫荧光染色检测SETD2及H3K36me3在猪卵母细胞IVM过程中各个时期（GV、MⅠ、MⅡ期）的表达定位情况；在GV期显微注射SETD2干扰RNA(SETD2-siRNA)构建干扰模型，检测干扰后对SETD2、H3K36me3、DNA双链断裂标志物（γH2AX）以及第一极体（PBI）排出率的影响；通过qPCR技术检测干扰后对DNA甲基化转移酶DNMT3B、凋亡和抗凋亡相关基因BAX、BCL2表达的影响。结果表明：SETD2信号GV期聚集在DNA周围，MⅠ和MⅡ期均在细胞质中表达，而H3K36me3在整个减数分裂过程中均与核共定位；进一步研究发现，SETD2-siRNA干扰后显著降低了SETD2和H3K36me3表达水平，增加了γH2AX表达（P<0.05），同时显著降低PBI排出率（P<0.05）;qPCR结果显示，SETD2-siRNA干扰后DNMT3... 相似文献
4.
[目的]明确猪miR-124与其靶基因IQGAP2间的表达调控关系,以及miR-124表达水平与猪巨噬细胞内沙门氏菌数量的关联,为揭示沙门氏菌在感染细胞内存活与增殖的机制提供理论依据.[方法]通过荧光素酶报告基因系统验证miR-124与IQGAP2基因的作用位点;再以GM-CSF诱导的猪巨噬细胞和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)为试验材料,通过实时荧光定量PCR和流式细胞术测定沙门氏菌感染猪巨噬细胞中miR-124和IQGAP2基因的表达及巨噬细胞内沙门氏菌的增殖情况.[结果]miR-124结合位点野生型载体转染的荧光报告信号显著低于miR-124结合位点突变载体(P<0.05,下同),但共转染anti-miR-124序列后能显著增强miR-124结合位点野生型载体的荧光报告信号.经沙门氏菌感染后,猪巨噬细胞中的miR-124表达被激活,感染12、24和48 h后的相对表达量均显著高于沙门氏菌感染前(0 h),而IQGAP2基因表达水平呈显著下调趋势;在沙门氏菌感染猪巨噬细胞内,miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平呈明显负相关(r=-0.92).miR-124高表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞,但miR-124敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著低于正常巨噬细胞;IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量显著高于正常巨噬细胞;此外,miR-124高表达+IQGAP2基因敲低表达组细胞内的沙门氏菌数量与IQGAP2基因敲低表达处理组相比无显著差异(P>0.05),但显著高于miR-124高表达组细胞.[结论]沙门氏菌感染猪巨噬细胞中的miR-124表达水平与IQGAP2基因表达水平及胞内沙门氏菌数量呈负相关,即沙门氏菌可通过上调miR-124表达靶向抑制IQGAP2基因表达,从而调节其在猪巨噬细胞内的增殖. 相似文献
5.
抗应激中药冲剂对猪肝脏热应激蛋白70表达的影响 总被引：2，自引：0，他引：2
研究抗应激中药冲剂对高温应激下猪肝脏组织热应激蛋白70(Hsp70)表达的调控效果。选取64头3月龄中国实验用小型猪,随机分为常温对照组、高温应激组、方Ⅰ、Ⅱ组,于高温第1,3,6,10天动态取样后,分别采用免疫组织化学和ELISA法测定肝中Hsp70的蛋白表达定位定量变化。结果表明,高温应激后,猪肝脏组织细胞阳性率显著增加(P<0.05),方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏细胞阳性率显著高于常温组(P<0.05)但低于高温组(P<0.05);ELISA方法结果显示高温组、方Ⅰ、方Ⅱ组肝脏组织Hsp70含量显著增加(P<0.05),方Ⅱ组Hsp70含量在第3,6天比高温组显著增加(P<0.05)。因此,中药抗应激冲剂可通过增加肝脏Hsp70蛋白含量水平来提高机体细胞热耐受,达到保护作用,且方Ⅱ组效果优于方Ⅰ组。 相似文献
6.
利用光学显微镜观察及地衣红染色方法,探究猪卵母细胞体外成熟过程中添加神经生长因子(NGF对猪卵丘细胞扩散和卵母细胞成熟的影响.结果表明:在猪卵母细胞体外成熟过程中添加NGF对猪卵丘细胞扩散无明显影响;单纯添加NGF并不能显著改变第二次减数分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的比率,但却可以显著提高生发泡期(GV期)卵母细胞比率.当NGF与促性腺激素(eCG和hCG)联合作用时,MⅡ期卵母细胞比率相对于单纯地促性腺激素作用有显著提高. 相似文献
7.
不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
[目的]系统比较了在成熟培养液中添加Leptin对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚的发育率和囊胚质量,同时比较了成熟培养液和胚胎培养液添加Leptin对孤雌激活胚发育的影响。[方法]成熟培养液中添加不同浓度Leptin对猪卵母细胞体外成熟和早期孤雌发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目,并且研究了成熟培养液和胚胎培养液单独或联合添加Leptin对猪早期孤雌胚胎发育能力的影响及囊胚的内细胞团细胞数目。[结果]成熟培养液中添加不同浓度Leptin(0,10,50,100和200 ng/ml),体外成熟44 h,卵母细胞核成熟率统计分析差异不显著(P>0.05);将核成熟卵母细胞进行化学激活,第2天胚胎卵裂率统计分析差异不显著(P>0.05),但100ng/ml组与其他组第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数差异显著(P<0.05);成熟液添加Leptin 100 ng/ml、胚胎培养液添加Leptin 10 ng/ml与其他组第7天的囊胚率及囊胚的内细胞团细胞数差异显著(P<0.05)。[结论]Leptin对卵母细胞成熟和孤雌胚胎发育能力上有相辅相成的作用。 相似文献
8.
该研究主要运用单细胞免疫荧光技术分析猪卵母细胞和克隆胚胎发育过程中,H3K4和H3K9三甲基化(H3K4me3,H3K9me3)的表达情况.收集体外成熟0h,6h,12h,24h,30h,36h,42h的猪卵母细胞;同时通过体细胞核移植操作获得一细胞、四细胞、桑葚胚和囊胚期克隆胚胎,经过免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察H3K4me3和H3K9me3修饰在卵母细胞和胚胎中的变化情况.免疫荧光结果显示,在不同减数分裂阶段的猪卵母细胞内均能观察到H3K4me3的表达,并且呈现出逐渐下降的趋势;在生发泡期(GV),生发泡晚期(L-GV)和生发泡破裂(GVBD)阶段的卵母细胞中能发现明显的H3K9me3表达,随着减数分裂的进行,H3K9me3表达消失,在第一次减数分裂中期前阶段(Pre-MI)到第二次减数分裂中期(MⅡ)阶段卵母细胞中未发现H3K9me3荧光信号.H3K4me3和H3K9me3在不同发育阶段的猪克隆胚胎中都有表达,其中H3K4me3在不同阶段胚胎中荧光信号强度相近,H3K9me3在四细胞胚胎中荧光强度降低,在桑葚胚和囊胚中荧光强度出现升高的趋势.以上结果说明,H3K4me3参与调控猪卵母细胞体外成熟的整个过程,H3K4me3和H3K9me3在猪体细胞核移植胚胎早期发育过程中可能具有调控作用. 相似文献
9.
[目的]本试验旨在研究黄芪多糖(APS)对H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞凋亡、氧化损伤及相关基因、蛋白表达的影响。[方法]体外培养奶牛乳腺上皮细胞并用H_2O_2(600μmol·L~(-1),2 h)诱导建立乳腺上皮细胞氧化应激模型;试验分组:空白对照组、H_2O_2组、H_2O_2+APS组(8 mg·mL~(-1)APS)。[结果]与空白对照组相比,H_2O_2组细胞活力显著下降(P0.05);与H_2O_2组相比,H_2O_2+APS组的细胞凋亡率和细胞中的活性氧(ROS)含量均显著降低(P0.05),而超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著升高(P0.05),从而缓解H_2O_2诱导奶牛乳腺上皮的氧化损伤;此外,与H_2O_2组相比,H_2O_2+APS组凋亡基因Bax/Bcl-2 mRNA比值及Caspase-3 mRNA的表达量极显著降低(P0.01),Bax蛋白表达水平显著降低(P0.05),且APS降低了H_2O_2诱导细胞凋亡率。[结论]APS能够提高H_2O_2诱导的奶牛乳腺上皮细胞抗氧化酶活性,并减缓氧化损伤引起的奶牛乳腺上皮细胞凋亡。 相似文献
10.
[目的]本文旨在探究玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)对湖羊睾丸间质细胞(leydig cells, LC)的毒性作用。[方法]用200μmol·L-1 ZEA处理湖羊LC 8 h,通过EdU法检测细胞增殖情况，RT-qPCR和Western blot分别检测与细胞增殖和凋亡、氧化应激、m6A甲基化修饰相关基因和蛋白的表达变化。[结果]与对照组相比，ZEA处理组LC活性和增殖数量极显著下降(P<0.01);细胞增殖相关基因pcna及其蛋白表达水平均极显著下降(P<0.01);促凋亡基因表达水平(bax、caspase3,P<0.01;tp53、caspase9,P<0.05)均显著升高，相对应蛋白表达水平(TP53、CASPASE9,P<0.01)极显著升高；抗凋亡基因bcl-2及蛋白表达水平显著降低(P<0.05);氧化应激相关基因相对表达水平(cat,P<0.05;gsh-px、sod2,P<0.01)显著或极显著上升，其相关蛋白表达水平(SOD2,P<0.01)极显著上... 相似文献
11.
[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。 相似文献
12.
[目的]研究在不同条件下小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体的变化,为卵母细胞纺锤体的研究提供参考依据。[方法]在不同条件下处理小鼠MⅡ期卵母细胞,通过免疫细胞化学方法和激光共聚焦扫描显微镜观察其纺锤体变化。[结果]卵母细胞在25℃、20 min时纺锤体异常,25℃、30 min或4℃、10 min时纺锤体缺失;5、10、20和40μg/ml细胞松弛素B(CB)作用2 h未对纺锤体产生影响;卵母细胞在20μmol/L秋水仙素中作用1 h纺锤体异常,40μmol/L时作用1 h纺锤体缺失;在4%多聚甲醛中4℃条件下,卵母细胞纺锤体结构以固定时间为1~12 h效果较好。[结论]小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体对外界环境变化敏感,体外操作时控制外部环境是保持卵母细胞纺锤体正常生理功能的关键。 相似文献
13.
[目的]本试验旨在探讨脂肪因子Chemerin在牛卵巢颗粒细胞凋亡与自噬中的作用。[方法]体外培养牛卵巢颗粒细胞并用重组Chemerin蛋白(0.2μg·mL~(-1))处理24 h,采用流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡,通过免疫荧光检测细胞中活性氧(ROS)含量变化,测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)含量;RT-qPCR分析凋亡与自噬相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3、P62和Atg7 mRNA表达,Western blot技术检测凋亡与自噬相关蛋白表达情况。[结果]与对照组相比,Chemerin处理卵巢颗粒细胞后,细胞中ROS和MDA含量显著上升(P0.05),SOD和GSH-px活性极显著降低(P0.01)。凋亡相关基因Bax和Caspase-3 mRNA及蛋白表达水平显著升高,P62和Atg7 mRNA等的表达也显著上调(P0.05)。[结论]Chemerin可通过调控相关基因的表达诱导牛卵巢颗粒细胞凋亡并伴随自噬的发生。 相似文献
14.
[目的]本试验在已有研究血管紧张素系统(RAS)在乳腺中保护作用的基础上,对该家族的主要成员血管紧张素转换酶2(ACE2)在对抗高精料所致奶牛乳腺氧化应激、炎性损伤及细胞凋亡中的作用及机制进行了探讨。[方法]6头健康的泌乳期荷斯坦奶牛,随机分为对照组[m(精)∶m(粗)=4∶6]和高精料组[m(精)∶m(粗)=6∶4],采用单栏、定时、定量饲喂。饲喂20周后,活体取乳腺组织,进行如下试验:1)测定乳腺组织中氧化应激指标·OH水平及TNOS、SOD活性;2)ELISA法测定炎性指标TNFα、IL-1β和凋亡指标Caspase-3、Bax、Bcl-2;3)Western blot分析乳腺组织中ACE2和ACE蛋白的表达;ELISA法测定AngⅡ和Ang1-7的含量。[结果]高精料长期饲喂,奶牛乳腺组织中·OH自由基水平显著升高(P0.05),SOD活性降低,TNOS活性降低显著(P0.05);炎症因子TNF-α和IL-1β水平均显著升高(P0.05);促凋亡蛋白Caspase-3和Bax水平显著升高(P0.05),抑制凋亡蛋白Bcl-2水平显著降低(P0.05);乳腺组织中AngⅡ浓度(P0.05)和ACE蛋白表达水平极显著升高(P0.01),ACE2蛋白表达水平降低(P0.05),但Ang1-7浓度显著降低(P0.05)。[结论]长期饲喂高精料可导致奶牛乳腺自由基激活、炎症因子释放、细胞凋亡,乳腺局部损伤。乳腺局部组织中RAS处于激活状态,2条轴互相拮抗,表现为AngⅡ水平升高,ACE2水平降低。 相似文献
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研究了生长激素(STH)和胰岛素(Insulin)对体外培养猪COCs卵母细胞成熟及孤雌激活后卵裂、卵丘细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响,结果表明:STH和Insulin对卵母细胞的成熟和激活后卵裂具有双重效应.培养液中添加适当浓度的STH(0.151μg·mL-1)或Insulin(51μg·mL-1)可提高卵母细胞成熟率和卵裂率,与对照组及其他试验组相比差异显著(P<0.05).在猪COCs体外成熟过程中,适当浓度STH和Insulin能抑制卵丘细胞凋亡,抑制Bax在卵丘细胞的表达. 相似文献
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《南京农业大学学报》2016,(5)
[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)诱导PC12细胞凋亡及对相关基因Bcl-2、Bax、Bid mRNA和蛋白cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9表达水平的影响。[方法]用不同质量浓度的DON(0、125、250、500、1 000和2 000 ng·m L~(-1))对PC12细胞染毒24 h,采用透射电镜观察、流式细胞术、荧光定量PCR、Western-blot等方法,研究DON对PC12细胞的超微结构、凋亡率、凋亡相关基因及蛋白表达的影响。[结果]不同浓度的DON均可诱导细胞凋亡,各试验组细胞凋亡率均极显著高于对照组(P0.01),并随着染毒剂量的增加而升高,在1 000 ng·m L~(-1)时达到峰值;与对照组相比,各试验组Bax mRNA表达水平和Bax/Bcl-2值均极显著增加(P0.01),Bcl-2 mRNA表达水平在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01),而Bid mRNA表达水平在DON浓度超过250 ng·m L~(-1)时极显著下降(P0.01);Western-blot检测结果显示,各试验组cleaved-Caspase 9蛋白表达量均极显著高于对照组(P0.01),而cleaved-Caspase 3蛋白表达量在DON浓度超过500 ng·m L~(-1)时极显著增加。[结论]DON能够诱导PC12细胞发生凋亡,凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Bid及蛋白Caspase3、Caspase9等参与了DON诱导PC12细胞凋亡的调控。 相似文献
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[目的]本试验旨在研究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)对体外培养的仔猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)增殖、凋亡和屏障功能的影响,探讨DON的肠道毒性作用及相关机制。[方法]以不同浓度(0、0.5、1、2、4、8、和16μmol·L~(-1))DON处理IPEC-J2细胞24 h后,采用MTT、Hoechst 33258、Western blot、Millipore-ERS和IFA法检测DON对IPEC-J2细胞增殖、凋亡、屏障功能和自噬水平的影响;在4μmol·L~(-1) DON处理组添加自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)来提高细胞的自噬水平,用上述方法检测Rapa对DON引起的IPEC-J2细胞增殖毒性、凋亡和屏障功能的影响。[结果]与对照组相比,当DON浓度为4、8和16μmol·L~(-1)时,细胞活性显著(P0.05)或极显著(P0.01)下降。4和8μmol·L~(-1) DON处理凋亡细胞数量和凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3表达显著增加(P0.01),细胞跨膜电阻(TEER)值和紧密连接蛋白Occludin表达显著下降(P0.05),自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Atg5表达显著下降(P0.05)。添加Rapa可以显著缓解DON引起的细胞毒性、凋亡和屏障功能障碍。[结论]DON通过抑制自噬引起IPEC-J2细胞增殖下降、凋亡增加和屏障功能障碍。 相似文献
18.
[目的]本文以猪肠道上皮IPEC-J2细胞为模型,探究不同水平丙酸钠对细胞紧密连接和炎症细胞因子的影响。[方法]分别用1和10 mmol·L~(-1)丙酸钠处理IPEC-J2细胞,以不加丙酸钠处理IPEC-J2细胞为对照组,分别处理12 h和24 h后测定各组细胞活力、跨膜电阻(TEER)值、紧密连接相关蛋白及炎症细胞因子基因表达和细胞上清液中炎症因子浓度。[结果]丙酸钠处理24 h后,处理组细胞活力显著下降(P0.05),细胞的TEER值则显著上升(P0.05)。RT-qPCR结果显示,紧密连接相关蛋白Claudin中,不同浓度丙酸钠处理12和24 h后,显著下调Claudin-1 mRNA的表达(P0.05),但显著上调Claudin-2、Claudin-3和Claudin-4 mRNA的表达(P0.05)。紧密连接相关蛋白ZO中,处理12和24 h时,1和10 mmol·L~(-1)丙酸钠分别显著上调ZO-2 mRNA和ZO-1 mRNA的表达(P0.05),但10 mmol·L~(-1)丙酸钠则显著下调ZO-2 mRNA的表达(P0.05)。不同浓度丙酸钠处理12和24 h均显著上调炎症细胞因子IL-8、IL-18和TNF-αmRNA的表达(P0.05),显著下调IL-6 mRNA的表达(P0.05)。ELISA测定结果表明,丙酸钠显著刺激IL-8和TNF-α的分泌(P0.05),对IL-18和IL-6的分泌则无显著影响(P0.05)。[结论]丙酸钠选择性上调紧密连接蛋白家族相关基因的表达,一定程度上维护小肠上皮细胞屏障功能的完整性,同时调节细胞炎症反应,揭示丙酸在调节小肠上皮细胞屏障功能以及炎症反应过程中发挥重要作用。 相似文献
19.
[目的]该研究旨在探讨PCV2感染猪皮肤源树突状细胞内源性抗原加工提呈相关分子转录水平的变化。[方法]用猪圆环病毒2型(PCV2)感染40日龄健康长白仔猪,于感染后3、7、14、21、35天宰杀,收集皮肤源树突状细胞(DCs)。利用实时荧光定量PCR技术对感染仔猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈相关分子(LMP7,UBP,MHC-I,calreticulin)mRNA水平的变化进行定量分析。[结果]LMP7转录水平在感染后3天显著下调(P<0.05),UBP转录水平始终上调,其中在21天和35天显著上调(P<0.05),MHC-I转录水平在7天显著下调(P<0.05),calreticulin转录水平虽有所上调,但差异不明显。[结论]以上结果表明,PCV2在感染早期可抑制猪皮肤源DC内源性抗原加工提呈能力。 相似文献
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【目的】探明Cdc42蛋白在牛卵母细胞成熟过程中的表达及分布规律,并且研究抑制Cdc42活性对于牛卵母细胞成熟的影响。【方法】首先通过收集体外成熟不同时间（0-24 h）的牛卵母细胞,用Western blotting的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达量变化情况,通过免疫细胞化学的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的分布及定位情况。根据GenBank公布的牛Cdc42基因（GenBank登录号：NM_001046332.1）的mRNA序列设计引物,并在正向和反向引物的末端分别加上KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点,用PCR的方法扩增牛Cdc42基因的CDS区,将PCR产物和pMD19T载体连接得到野生型的克隆载体pMD19T-Cdc42WT。用定点突变引物以pMD19T-Cdc42WT为模板进行PCR反应,得到Cdc42的显性负性突变体Cdc42T17N的克隆载体pMD19T-Cdc42T17N。将pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N分别酶切后,将Cdc42WT（775 bp）和Cdc42T17N（775 bp）片段分别连接到pcDNA3.1（+）的多克隆位点区域,得到相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N。用体外转录的方法分别得到Cdc42WT和Cdc42T17N的cRNA,用显微注射的方法将相应的cRNA分别注入到牛GV期卵母细胞质内,检测其成熟率的变化。【结果】①Cdc42蛋白分别在牛卵母细胞中成熟培养0、4、8、12、16、20以及24 h时表达量没有明显差异,但是其分布规律随着减数分裂的进行发生着动态的变化：Cdc42蛋白在卵母细胞皮质区域集中分布的模式在生发泡（germinal vesicle,GV）期卵母细胞中很少出现,而在第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ,MⅠ）卵母细胞中出现得最多也最为明显;Cdc42蛋白在染色体附近的皮质富集的现象开始出现于前中期（pro-metaphase Ⅰ,pMⅠ）,并且出现频率从pMⅠ期到第2次减数分裂中期（metaphase Ⅱ,MⅡ）逐渐增多;Cdc42蛋白和纺锤体重叠定位的现象在第1次减数分裂后期（anaphase Ⅰ,AⅠ）到末期（telophaseⅠ,TⅠ）的卵母细胞中占有有很高比例,而到MⅡ期时这种现象又很少出现。②从牛卵母细胞的总cDNA中扩增Cdc42基因得到785 bp的片段,构建的牛Cdc42的野生型及其显性负性突变体的克隆载体pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N经酶切鉴定和以及测序比对后,符合预期结果,即成功克隆了牛野生型Cdc42基因并得到其显性负性突变体Cdc42T17N;③构建的相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N经酶切鉴定和测序比对,符合预期结果,经过体外转录均得到一个3079 bases和987 bases的RNA片段,符合预期结果,即成功构建了相应的原核表达载体并获得相应的cRNA;④与正常成熟培养组和注射Cdc42WTcRNA的牛卵母细胞相比,注射Cdc42T17NcRNA的成熟率显著降低（P<0.05）。【结论】卵母细胞在卵泡发育过程中就已经积累了足够的Cdc42蛋白,而在减数分裂过程中Cdc42可以在卵母细胞的皮质以及纺锤体的位置发挥作用,而且正常的Cdc42活性是牛卵母细胞完成成熟过程并排出第一极体所必需的。 相似文献