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为深入研究拟穴青蟹Scylla paramamosain阴离子抗菌肽SCY2的抗菌活性,将抗菌肽SCY2的成熟肽序列与毕赤酵母Pichia pastoris的p PIC9K质粒连接,构建了分泌型表达载体p PIC9K-SCY2,用电击法将其转化至毕赤酵母GS115菌株中,经甲醇诱导表达和亲和纯化后获得目的蛋白,并进行质谱鉴定和抗菌活性分析。结果表明:本研究中成功构建了重组毕赤酵母菌株GS115/p PIC9K-SCY2,用0.5%甲醇诱导表达24 h后,分泌表达上清液中获得了相对分子质量约11 000的稳定表达产物,与预期的抗菌肽SCY2成熟肽的大小相符;纯化后的目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;抗菌活性结果表明,抗菌肽SCY2能抑制革兰氏阳性菌生长,对被测的革兰氏阴性菌无抑杀活性(50μmol/L);抗菌肽SCY2同抗生素进行协同抗菌试验,发现SCY2与四环素协同使用对荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens的抑杀存在协同作用,SCY2与青霉素协同使用对施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri的抑杀具有增强作用。研究表明,较低浓度的抗生素与抗菌肽协同使用可有效地减少抗生素的使用,降低食品中抗生素的残留风险。 相似文献
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为了在毕赤酵母中获得牛气管抗菌肽(bTAP)的表达,根据已发表的牛气管抗菌肽序列和毕赤酵母对密码子的偏爱性设计2对引物,采用重叠延伸PCR法获得bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC9K质粒连接,构建表达载体pPIC9 K-b TAP.用Sal Ⅰ酶切线性化pPIC9 K-b TAP质粒后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导其表达.SDS-PAGE分析结果表明表达的重组蛋白质分子量正确,抑菌试验结果表明表达的重组蛋白质bTAP对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果. 相似文献
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根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP.获得重组质粒经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌.通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组... 相似文献
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东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的表达、纯化及抑菌活性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】利用毕赤酵母菌真核表达系统重组表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST,分析评价dybowskin-1ST的抑菌活性。【方法】采用TRIzol法提取蛙皮总RNA,经RT-PCR扩增获得抗菌肽dybowskin-1ST基因,将目的基因克隆到毕赤酵母菌分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组质粒pPIC9K-1ST。经电转化将pPIC9K-1ST转入到毕赤酵母菌GS115中,获得高效表达dybowskin-1ST的重组菌株。以甲醇诱导重组菌株,上清液经SDS-PAGE检测表明有目的蛋白dybowskin-1ST分泌表达。目的蛋白经Ni-agarose色谱柱分离纯化后,对大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肠炎沙门氏菌和蜡状芽孢杆菌进行抑菌活性分析。【结果】成功构建了东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST的毕赤酵母真核表达系统,且dybowskin-1ST对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好的抑菌效果。【结论】东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST具有良好的广谱抗菌活性和潜在的研发价值。 相似文献
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《江苏农业科学》2015,(9)
从巴什拜羊外周血多形核粒细胞(PMN)中提取总RNA,经RT-PCR扩增出巴什拜羊BPI基因片段,将其克隆至p PIC9K载体中,构建真核表达质粒p PIC9K-BPI,经PCR、酶切及测序鉴定正确后,电转化至毕赤酵母GS115中并用甲醇诱导表达,SDS-PAGE鉴定重组BPI蛋白的表达,通过微量肉汤稀释法检测重组BPI蛋白的抑菌活性。结果表明:RT-PCR扩增获得597 bp巴什拜羊BPI基因;经PCR、酶切及测序鉴定证实成功构建BPI基因的真核表达载体,SDS-PAGE检测结果表明,重组BPI蛋白成功表达,通过抑菌试验表明表达的重组BPI蛋白具有明显抑菌活性。 相似文献
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《江西农业学报》2022,(2)
根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。 相似文献
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《江西农业学报》2017,(2)
根据凡纳滨对虾抗菌肽Lvcrustin-B的核酸序列,采用PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成Lvcrustin-B基因,通过双酶切及T4连接酶技术将Lvcrustin-B插入表达载体p YE-GAPα,获得重组酵母表达载体p YEGAPα-Lvcrustin-B。p YE-GAPα-Lvcrustin-B经限制性内切酶AVr II线性化后,通过电穿孔法转化至毕赤酵母细胞GS115,并使用Zeocin进行抗性筛选,从而获得高拷贝转化子,筛选出的酵母菌转化子经扩大培养后使用YPD培养基进行诱导表达。PCR检测结果表明Lvcrustin-B基因被稳定整合至毕赤酵母染色体。SDS-PAGE电泳及WB实验显示,目的重组蛋白Lvcrustin-B可在毕赤酵母中表达,分子量大小为19.4 k D,且表达方式为可分泌性表达,重组菌最佳培养温度为30℃。 相似文献
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以水稻根系c DNA为模板,PCR扩增含His标签的Lsi1基因开放阅读框,并将该基因克隆到巴斯德毕赤酵母表达载体p PIC9k中,PCR及测序验证重组质粒p PIC9k-Lsi1目的基因序列.将验证正确的重组质粒p PIC9k-Lsi1通过SacⅠ酶切线性化,电转到毕赤酵母GS115感受态细胞中,通过MD/MM板筛选出甲醇利用快型的酵母转化子,再通过不同浓度梯度的G418平板筛选多拷贝转化菌株.提取酵母基因组,PCR验证正确的菌株即为工程菌(GS115/p PIC9k-Lsi1).用1%甲醇诱导该工程菌72 h后,收集上清,经SDS-PAGE检测到位于32.8 ku处的目的蛋白即为Si转运蛋白(Os Lsi1). 相似文献
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本研究在克隆获得玉米大斑病菌1,3,8-三羟基萘还原酶基因(St3HNR)的基础上,拟对该基因编码产物进行异源表达分析,明确基因功能.试验利用毕赤酵母真核表达系统,构建了玉米大斑病菌St3HNR基因的真核表达载体pPIC9K-St3HNR,采用电击转化法将重组质粒转入表达宿主菌GS115中得到了重组酵母菌株,经甲醇诱导... 相似文献
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为通过毕赤酵母的表达获得鸡NPY蛋白,根据GenBank上的鸡NPY基因序列,结合毕赤酵母密码子的偏好性合成编码鸡NPY蛋白的基因,将其插入真核表达载体pPICZαA,构建重组表达质粒pPICZαA-NPY,并将重组质粒电转入毕赤酵母GS115,获得重组毕赤酵母菌GS115/pPICZαA-NPY,用终浓度为1%的甲醇诱导表达阳性转化菌,用Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测表达蛋白。结果成功构建表达载体pPICZαA-NPY,转化后的重组酵母菌成功分泌鸡NPY蛋白,获得分子量约为35 kDa的鸡NPY蛋白。 相似文献
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《郑州牧业工程高等专科学校学报》2015,(1)
牛中性粒细胞β防御素5(BNBD5)是天然存在于牛肺脏肺泡巨噬细胞内的一种抗菌肽之一。为了进一步研究天然抗菌分子-防御素的抗分枝杆菌活性提供实验材料,通过克隆BNBD5成熟肽片段的编码区序列,成功构建了毕赤酵母表达载体pPIC9K/mBNBD5,并诱导其在毕赤酵母菌株GS115中成功表达了mBNBD5蛋白,从而为进一步的实验奠定了坚实的基础。 相似文献
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[目的]检测克隆猪α干扰素基因（IFN-α基因）在毕赤酵母中的表达。[方法]经植物血凝素（PHA）诱导后,提取猪外周血淋巴细胞,并用RT-PCR方法获得IFN-α基因,将该基因与真核表达质粒pPIC9K连接,并电转入毕赤酵母GS115菌中,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE电泳检测IFN-α蛋白表达,Western-blot分析IFN-α蛋白活性。[结果]重组转化菌株经甲醇诱导后能表达相对分子质量约为19kD的蛋白质,该蛋白质能与相应抗体产生免疫反应。[结论]实现了猪功能性IFN-α基因表在毕赤酵母中表达,为进一步探讨IFN-α的生物学活性研究奠定了基础。 相似文献
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为了解山羊内在防御系统中发挥的重要作用,在山羊防御素保守序列的基础上设计了12条不同理化性质的防御素(DGBD1~12)基因,克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA的EcoR I和Not I酶切位点,构建重组表达载体pPICZαA-DGBD。经SaI线性化后电击转化毕赤酵母GS115,经PCR鉴定阳性重组菌。经过摇瓶发酵和甲醇诱导,阳性重组菌的发酵上清液对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌等具有较强的抑制作用。最小抑菌浓度测定显示重组质粒对大肠杆菌的抑制作用最强。研究结果显示,疏水指数较高的序列DGBD1~DGBD3的抗菌活性较好,稳定指数较低的序列DGBD4~DGBD6抗菌活性仅次于疏水指数,说明DGBD结构稳定性和疏水性对其抗菌活性有较大影响。 相似文献
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枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。 相似文献
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乳源降血压七肽基因在毕赤酵母中的表达研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用基因工程技术在毕赤酵母中高效表达乳源抗高血压七肽,为大规模生产抗高血压肽奠定基础。根据毕赤酵母密码子偏爱性,人工合成了具有较高活性的抗高血压七肽串联基因序列。将串联基因克隆至表达载体pPIC9上,并转化毕赤酵母GS115,经PCR检测获得2株重组菌株。重组菌经甲醇诱导,表达的分泌蛋白经胰蛋白酶酶解,测定酶解产物抑制ACE酶活性。结果表明,表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物抑制ACE酶活性达到65.12%。IC50值为0.0203 mg.mL-1。研究成功合成了串联的13拷贝抗血压七肽基因,并实现了其在毕赤酵母中的高效表达,表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物具有抗高血压肽活性。 相似文献
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[目的]对抗菌肽SMAP-29的基因密码子进行优化,并使其在毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中表达。[方法]根据已知抗菌肽SMAP-29的氨基酸序列,参照毕赤巴斯德酵母密码子的偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,并同载体pPIC3.5K连接,电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。用甲醇诱导表达构建好的重组酵母表达基因工程菌,并裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析。[结果]在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的SMAP-29分子量相当,约为3.2 kD的表达带;表达产物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。[结论]该研究为SMAP-29在生物医学、农业等领域中的应用奠定基础。 相似文献
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鸡源抗菌肽Folicidin-3在毕赤酵母中的分泌表达及其生物学活性鉴定 总被引：2，自引：1，他引：1
【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170mg·L-1,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9cm和2.2cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH6.0),每24h补加2%甲醇,29℃培养72h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。 相似文献
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【目的】研究鸡源重组抗菌肽Fowlicidin-3的生物学特性,并为重组抗菌肽在临床上的应用奠定基础。【方法】根据抗菌肽数据库中Fowlicidin-3的氨基酸序列,选用毕赤酵母的偏嗜密码子,设计抗菌肽的基因,通过SOE法合成得到全长为114 bp的Fowlicidin-3基因。将Fowlicidin-3基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-F。将线性化重组表达载体pPICZα-A-F通过电击法转入毕赤酵母宿主菌X-33中,构建分泌型重组酵母表达菌株。【结果】获得分泌型重组酵母表达菌株,Fowlicidin-3多肽表达量达到170 mg?L-,对致病性大肠杆菌K99和鸡白痢沙门氏菌显示出较好的抑制活性,抑菌圈直径分别为1.9 cm和2.2 cm。优化表达条件结果显示,转接到BMMY培养基中(pH 6.0),每24 h补加2%甲醇,29℃培养72 h后,Fowlicidin-3抗菌肽获得高效表达。【结论】成功构建分泌型重组酵母表达菌株,并获得了具备高效表达能力和较好生物学活性的抗菌肽。 相似文献