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为解决绵羊肺炎支原体感染的预防问题,建立一种简单、快速、成本低的诊断方法,构建绵羊肺炎支原体EF-Tu基因原核表达载体,诱导纯化重组蛋白并用Western blot分析其反应原性,以重组蛋白为诊断抗原,建立绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法,评估其特异性和灵敏性。结果表明,构建的重组蛋白纯化后,经Western blot证实具有良好的反应原性;间接ELISA反应条件优化显示,抗原稀释度为0.25μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶50,最佳孵育时间为90 min,封闭液为50 g/L脱脂奶粉,二抗最佳稀释倍数为1∶8 000,最佳孵育时间为60 min,特异性与灵敏性良好;该方法与间接血凝法对100份血清进行检测,两者符合率为88.7%。说明试验建立的绵羊肺炎支原体间接ELISA检测方法可以推广使用。 相似文献
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为建立绵羊支原体(Mycoplasma ovis)的血清学检测方法,根据GenBank收录的绵羊支原体HSP70蛋白C端的基因序列(登录号：CP006935.1),构建了重组原核表达质粒。通过原核表达获取重组蛋白,并将纯化的重组蛋白作为包被抗原,建立了绵羊支原体间接ELISA抗体检测方法。结果显示,成功构建了绵羊支原体HSP70蛋白的重组原核表达质粒;重组蛋白在大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞中,同时以可溶性蛋白和包涵体蛋白的形式表达;以重组蛋白作为包被抗原建立的绵羊支原体间接ELISA抗体检测法,抗原包被最佳浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶2 000。建立的ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,为绵羊支原体的检测及试剂盒的开发提供了技术支持。 相似文献
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通过对布鲁菌优势抗原eryA基因进行原核表达,在获得目的蛋白的基础上建立以该蛋白为包被抗原的间接ELISA方法。构建原核表达载体pET-30a-eryA,并将其转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,镍柱亲和纯化eryA重组蛋白,SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白,Western-Blotting检测反应原性后建立间接ELISA方法。反应条件优化后,抗原包被浓度为0.312 5 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液为5%猪源明胶,37 ℃作用2 h;血清稀释度为1∶100,37 ℃作用1 h;酶标抗体稀释度为1∶8 000,37 ℃作用45 min。血清稀释度为1∶1 600时,仍然检测为阳性,证明建立的间接ELISA方法灵敏性良好;其他菌种及病毒经过特异性检测,均为阴性,证明建立的间接ELISA方法特异性良好;通过重复性检测,批间及批内变异系数均小于10%,证明建立的间接ELISA方法重复性良好。检测临床血清样品,建立的方法与试管凝集试验总符合率为95.7%,证明该方法可初步应用于临床诊断。 相似文献
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为了构建气肿疽梭菌细胞毒素A(CctA)基因真核表达载体,探讨制备安全有效气肿疽核酸疫苗的可行性,试验根据NCBI上气肿疽CctA基因序列,通过Primer Premier 5.0设计了1对特异性引物用于基因扩增,将PCR扩增的CctA基因克隆至pMD19-T载体构建重组质粒pMD19-T-CctA,对测序正确的基因进行序列分析后亚克隆至pVAX-1真核表达载体,并对构建的pVAX1-CctA真核表达质粒进行PCR和双酶切鉴定。结果表明:成功扩增了CctA基因目的片段,并获得了与预期大小相符的重组质粒pMD19-T-CctA和真核表达质粒pVAX1-CctA。说明试验成功构建了气肿疽CctA基因真核表达载体。 相似文献
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【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1∶25 600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为：抗原包被浓度为5μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250... 相似文献
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猪圆环病毒2型ORF2基因原核表达蛋白间接ELISA检测方法的建立及应用 总被引：6，自引：0，他引：6
对含有已构建的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET-ORF2s的BL21菌进行诱导表达,纯化重组蛋白包涵体,Western-blot检测纯化蛋白,将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,建立可检测PCV2血清抗体的间接ELISA方法。用该方法对吉林省多个种猪场收集的179份血清样品进行检测,总阳性率为42.5%。由此说明,本试验建立的PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,适用于大规模猪场血清学检测。 相似文献
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为了获得具有反应原性的重组蛋白,以该蛋白建立初步的间接ELISA检测方法。本研究通过RT-PCR从猪粪便中克隆了戊型肝炎病毒（HEV）ORF2与急性期血清反应的抗原决定簇基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,命名为pET32a-ORF2-62,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用1.0mmol/L IPTG进行诱导表达,通过Western-blotting检测其反应原性,并利用镍柱亲和层析纯化所获目的蛋白。结果,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量约为30 600,Western-blotting显示重组蛋白与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的反应原性。经方阵滴定确定最佳包被浓度为7.7mg/L,血清最佳稀释比为1∶40。利用大肠杆菌表达的HEV重组蛋白建立了间接ELISA检测方法,此方法的建立为戊型肝炎早期诊断提供了一种快速简便的血清学诊断方法。 相似文献
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本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒（PEDV）S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段（S2A）,将其克隆后插入原核表达载体pET-32a（+）中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1：32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。 相似文献
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本研究以布鲁菌Rev.1株基因组为模板,扩增BAB基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,获得重组质粒pET-30a-BAB,对重组质粒进行原核表达,经Western blotting检测后,利用表达产物构建检测布鲁菌病的间接ELISA方法。结果表明,本试验成功克隆并表达了BAB基因,纯化表达产物经SDS-PAGE分析显示,本研究获得较纯的重组BAB蛋白;Western blotting试验表明,表达蛋白可与布鲁菌羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性;以重组BAB蛋白作为包被抗原,建立并优化了检测BAB抗体的间接ELISA方法。确定最佳包被条件：BAB蛋白包被量0.25 μg/mL,血清稀释度为1：400;封闭液为3%猪源明胶;二抗稀释度为1：6 000;显色时间为10 min。应用建立方法对临床40份羊血清进行检测,计算得出临界值为0.607。即当待检血清的P/N ≥ 1.5,且D450 nm ≥ 0.607时,判定为阳性,当D450 nm ≤ 0.561时,判定为阴性,当0.607 < D450 nm < 0.561时,判定为疑似值,需要进行复检。与虎红平板试验和试管凝集试验比较,阳性符合率为100%,阴性符合率为71.88%,总符合率为77.5%。 相似文献
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本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。 相似文献
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【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。 相似文献
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本试验对猪脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus,EMCV）2A蛋白进行原核表达和纯化。采用大肠杆菌原核表达系统,将EMCV 2A基因插入原核表达载体pET-28a-sumo中构建重组原核表达质粒pET28a-EMCV-2A,经PCR和测序鉴定无误。将重组原核表达质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,超声破碎后,2A蛋白的表达主要以包涵体形式存在。通过优化蛋白表达条件,使目的蛋白能够实现可溶性表达。利用磁珠纯化方法对重组蛋白进行纯化,并以SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,本试验成功构建2A的重组表达质粒;重组蛋白分子质量约为25 ku,与预期大小一致;IPTG浓度1.0 mmol/L、16 ℃低温诱导16 h为最佳诱导条件,约有50%的蛋白呈现可溶性表达;纯化后获得2A重组蛋白。本试验通过对EMCV 2A蛋白的原核表达及纯化,成功获得纯度较高的EMCV 2A蛋白,为进一步阐明EMCV的分子致病机制以及研发基因疫苗和抗病毒药物奠定基础。 相似文献
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试验旨在获得高纯度犬降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a（+）,未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1：51 200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示物。 相似文献
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为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1：80,酶标抗体的最佳稀释度为1：5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D450 nm值≥ 0.30为阳性,样品D450 nm值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。 相似文献
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【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具... 相似文献
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In the study,an indirect ELISA was developed using the purified thymidine kinase (TK) protein as antigens to detect the antibody of duck plague virus (DPV).The TK gene of DPV was amplified by PCR using specific primers designed according to the sequence of TK gene in GenBank.Using gene recombination technology,the TK gene was cloned and inserted into prokaryotic expression vector pET-32a and the recombinant plasmid was identified by PCR,double enzyme digestion and sequence analysis.The positive recombinant plasmid was then transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by IPTG.The expressed protein was purified by gel extraction and analyzed by Western blotting.Then an indirect ELISA was established to detect DPV antibody by using the purified recombinant TK as the coating antigen.The other assay conditions were also optimized.The recombinant plasmid was constructed successfully and Western blotting detected the target protein,TK recombinant protein could be recognized by positive serum,and the result indicated that the recombinant protein had good antigenicity.The optimum reaction conditions were as follow:The optimal dilution of enzyme labelled antibody was 1:200,the optimal dilutions of antigen and antibody were 1:400 and 1:200,reaction time was 60 min,most prefer blocking solution was 5% BSA,closed for 60 min,chromogenic time was 10 min.The method had good stability and high sensitivity,and it could provide a reliable method for the clinical detection,immunization surveillance,and prevention and cure of DP. 相似文献
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本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1:200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1:400和1:200,抗原抗体作用时间为60 min,最佳封闭液为5% BSA,最佳封闭时间为60 min,最佳显色时间为10 min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。 相似文献
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WANG Yuchen TIAN Guangyuan ZHOU Yaping GUO Ting ZHAO Hongmei SUN Yajie ZHAO Fengmiao BIAN Yuchen YU Jialiang HAO Yongqing 《中国畜牧兽医》2022,49(8):3122-3130
【Objective】 This study was aimed to verify whether the NP protein of Bovine parainfluenza virus type 3 (BPIV3) could enhance the immune effect of BPIV3 inactivated vaccine【Method】 The antigenicity of the protein encoded by NP gene was analyzed by bioinformatics softwares,and the antigenic region was screened.The truncated NP gene sequence of BPIV3 was amplified by PCR and connected to pET-32a(+) plasmid.Then the high-purity BPIV3 NP protein was obtained by E.coli prokaryotic expression system and Ni affinity chromatography.It was confirmed by Western blotting.BPIV3 was inactivated with 0.3% formaldehyde and mixed with Freund's adjuvant 1:1 to prepare inactivated vaccine.Eight New Zealand White rabbits were randomly divided into four groups with two rabbits in each group,including inactivated vaccine group,NP protein group,inactivated vaccine and NP protein mixed group and control group.Blood samples were collected before and every 7 days after immunization.The levels of specific antibodies and neutralizing antibodies in New Zealand White rabbits of the four groups were measured and compared by indirect ELISA and virus neutralization test.【Result】 DNAStar analysis showed that the average antigen index of amino acid region 193-368 of NP protein was 0.4-1.7,and the hydrophilic index was 0-1.5,which proved that this region had strong antigenicity and hydrophilicity.The NP gene was amplified by PCR and the recombinant expression vector was constructed.Gene sequencing showed that the recombinant expression vector was consistent with the expected results.The results of SDS-PAGE showed that NP protein was highly expressed with a molecular weight of 50 ku and expressed in the form of inclusion body.Western blotting showed that the expressed protein had strong reactivity.The results of ELISA showed that 28 days after immunization,the specific antibody titer of the control group was 0,and the specific antibody titers of inactivated vaccine group,NP protein group and inactivated vaccine and NP protein mixed group reached 1:211,1:217 and 1:218,respectively.The results of virus neutralization test showed that 28 days after immunization,the neutralizing antibody titer of the control group was 0,and the neutralizing antibody titers of inactivated vaccine group,NP protein group and inactivated vaccine and NP protein mixed group were 1:23.32,1:24.48 and 1:24.98,respectively.【Conclusion】 BPIV3 NP protein could enhance the immune effect of BPIV3 inactivated vaccine.Adding NP protein to the inactivated vaccine could be used as a new vaccination method of BPIV3 inactivated vaccine. 相似文献