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1.
《中国畜牧兽医》2018,(11)
为探究糖基化修饰对布鲁氏菌P39蛋白免疫原性的影响,本试验对布鲁氏菌P39蛋白进行了表达和纯化,并对表达的蛋白进行了甘露六糖修饰。参照GenBank公布的布鲁氏菌P39基因序列设计引物,从布鲁氏菌16M基因组中克隆P39基因片段并连接至pMD19-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取阳性菌株质粒进行酶切等鉴定,鉴定正确后构建重组质粒pGEX-6P-1-P39,对重组蛋白进行诱异表达与条件优化。利用SDSPAGE和Western blotting对诱导表达的目的蛋白进行分析,将鉴定正确的蛋白经GST亲和层析柱纯化。通过EDC/NHS法对纯化的P39蛋白进行甘露六糖修饰,研究甘露六糖修饰后目的蛋白对巨噬细胞吞噬的影响。结果显示,本试验成功克隆了片段大小为1 206bp的目的基因,构建了pGEX-6P-1-P39原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达了P39蛋白,该蛋白主要以可溶性形式存在。Western blotting结果显示,在约65ku处有特异性条带。纯化后获得目的蛋白大小为43ku,成功对目的蛋白P39进行了糖基化修饰,得到修饰产物与蛋白的摩尔比为2.3∶1。此外,糖基化修饰可显著提前蛋白激活小鼠巨噬细胞的吞噬作用时间。本试验结果可为研究甘露六糖修饰影响P39蛋白免疫原性的机制提供参考。 相似文献
2.
克隆羊外膜蛋白Omp25基因,在大肠杆菌中表达、纯化,并对Omp25蛋白的抗原性进行分析.以布鲁氏菌染色体DNA模板,扩增Omp25基因,双酶切后克隆至pET32a上,在大肠杆菌ER2566 (DE3)中诱导表达,组氨酸结合树脂柱纯化,Western blotting鉴定Omp25蛋白的免疫原性.将Omp25克隆至载体pET32a,提取的重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定和测序分析确定目的基因成功插入到了克隆载体中.将重组质粒转化于大肠杆菌ER2566 (DE3)中表达获得HIS融合蛋白,SDS-PAGE分析证明,表达产物为43 000的融合蛋白.Western blotting分析表明,所表达的蛋白具有免疫原性.结果表明,成功地表达并纯化了Omp25蛋白,而且纯化的蛋白具有一定的免疫原性.本试验为进一步研究Omp25蛋白的功能以及寻找布鲁氏菌的诊断性蛋白奠定了基础. 相似文献
3.
本研究采用RT-PCR方法从培养的鹅外周血淋巴细胞总RNA中成功扩增到鹅IFN-γ基因。将克隆在pMD18-T载体中的鹅IFN-γ基因插入原核表达载体pGEX-6P-1,得到重组质粒pGEX-6P-1-IFN-γ。重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后作SDS-PAGE分析,得到约43 ku融合表达蛋白特异条带。用GST亲和纯化柱对原核表达产物中目的蛋白进行纯化,得到1.2 mg/L的纯化蛋白。用100TCID50病毒量在鹅副黏病毒(GPMV)/鹅胚成纤维细胞系统上测定表达蛋白的抗病毒活性,观察不同处理组的细胞形态并用RT-PCR方法鉴定,发现表达蛋白稀释倍数小于104可抑制GPMV复制,按照Reed-Muench法计算表达的鹅IFN-γ抗病毒效价为2.0×103U/mL,表明表达蛋白具有良好的抗病毒活性。 相似文献
4.
新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析 总被引：2，自引：0，他引：2
应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性. 相似文献
5.
本研究对破伤风毒素C片段进行了基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出大小为1356 bp的破伤风毒素C片段(TetC)基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登录的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆至大肠杆菌融合表达载体pGEX-6P-1,构建成重组表达质粒pGEX-6P-1-TetC,并在大肠杆菌BL21中表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的21%。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为76 Ku左右的重组蛋白,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。 相似文献
6.
南非Ⅱ型口蹄疫主要抗原表位串联基因的表达及抗原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
在对南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原分析基础上,将已经筛选出的6条抗原性良好的多肽采用柔性linker拼接,人工合成相应核苷酸后连入T载体中。将酶切回收的串联基因(VP1-VP3)克隆于表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-VP1-VP3。该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3) plysS中,经IPTG诱导后进行了可溶性分析和Western blotting分析,且对融合蛋白柱上酶切纯化后进行了抗原性分析。重组质粒pGEX-VP1-VP3的PCR和测序结果表明,VP1-VP3串联基因已成功插入pGEX-6p-1载体中;pGEX-VP1-VP3融合蛋白分子质量约为38.3 ku,并以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该融合蛋白与南非Ⅱ型FMDV阳性血清能发生特异性反应;酶切纯化后蛋白间接ELISA鉴定结果表明,表达的VP1-VP3蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。串联多肽的成功表达,将为南非型口蹄疫血清学检测方法建立奠定基础。 相似文献
7.
本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。 相似文献
8.
以RT-PCR方法扩增目的基因P58IPK,将其克隆至原核表达质粒pGEX-6p-1.将所构建的pGEX-6p-1-P58IPK重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并诱导表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE、Western-blot及体外活性鉴定.结果显示,大肠杆菌细胞经诱导表达出相对分子质量约为85 000的蛋白,与GST-P58IPK融合蛋白大小相符;Western-blot显示该融合蛋白能够被抗GST的抗体特异性识别,磷酸化试验表明GST-P58IPK融合蛋白能够抑制PKR的体外磷酸化.结果表明,在大肠杆菌表迭系统中表达了有活性的GST-P58IPK融合蛋白,为PKR信号通路的研究奠定了基础. 相似文献
9.
《黑龙江畜牧兽医》2016,(13)
为了获得活性良好的布鲁氏菌基因工程抗原,对Brucella OMP25蛋白进行原核表达及初步应用,试验采用PCR方法从布鲁氏菌病S2疫苗株中扩增获得OMP25基因,构建了原核表达质粒p GEX-6P-1-OMP25,转化入大肠杆菌BL21中,经过IPTG诱导表达,应用Western-blot方法鉴定表达产物,并以纯化的OMP25重组蛋白为诊断用抗原,通过反应条件优化,初步建立Brucella抗体ELISA检测方法。又以羊布鲁氏菌普查检测血清120份为样本,采用试管凝集试验进行了比较分析。结果表明:成功构建了pGEX-6P-1-OMP25原核表达载体,并在BL21中得以诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot分析,重组蛋白分子质量约为49 ku,优化试验确定抗原的最佳包被浓度为3.5μg/m L,血清最佳稀释度为1∶20。试管凝集试验血清样本的阳性率为83%,采用OMP25作为包被抗原的阳性检出率为68%,二者的符合率为85%。说明OMP25作为间接ELISA包被抗原用于羊布鲁氏菌血清学检测具有良好的反应性和特异性。 相似文献
10.
为获得蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)25型的VP7原核表达蛋白,本试验以蓝舌病病毒重组质粒为模板,PCR扩增VP7基因,将其克隆于pET-24b(+)表达载体中,获得pET-24b-BTV-VP7重组质粒。经酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达His-BTV-VP7蛋白。在变性条件下用镍亲和层析柱纯化His-BTV-VP7蛋白,经Western blotting及ELISA鉴定其免疫原性。结果显示,His-BTV-VP7蛋白以包涵体形式表达,大小约为40 ku;Western blotting和ELISA检测此原核表达蛋白能与山羊阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性。本研究为后续建立蛋白芯片检测方法奠定了基础。 相似文献
11.
试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性，为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象，运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因，构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48，纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体，运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明，试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48，重组蛋白P48大小约为66 ku，纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应，血清抗体滴度达到较高水平（D450 nm值为1.126）。Western blotting结果显示，抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应，表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性，可作为牛支原体新型疫苗的候选基因，且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高，亲缘关系较近。 相似文献
12.
本研究以鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1基因为研究对象,设计特异性引物扩增S1抗原集中区目的基因,长度为198 bp,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-S1,转化至宿主菌Rosetta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,表达获得1条特异性蛋白条带,其分子质量大小为33.0 ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以包涵体形式存在。Western blotting结果显示,重组蛋白能与IBV鸡阳性高免血清反应,被GST标签单抗识别,结果表明该融合蛋白正确表达并具有良好的抗原性。本研究为制备IBV单克隆抗体奠定了抗原基础。 相似文献
13.
为了克隆和表达副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白TbpB基因,试验采用基因工程的方法对已发布的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计并合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得长为1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子质量约为41 ku,将该基因片段定向克隆至表达载体pGE X-6p-1中。结果表明:诱导表达后分子质量约为67 ku,与副猪嗜血杆菌阳性血清发生了特异性反应。说明该蛋白与抗体发生了反应,有一定免疫原性。 相似文献
14.
试验旨在构建EfaA基因的原核表达质粒,并对其进行表达。根据GenBank中粪肠球菌EfaA基因序列（登录号：U03756）设计合成1对引物,利用PCR法扩增、克隆EfaA基因,并进行生物信息学分析,将EfaA基因亚克隆于pGEX-4T-1原核表达载体,构建pGEX-4T-EfaA原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,用IPTG诱导表达,筛选最佳诱导时间并分析其表达蛋白的生物学特征。结果发现,试验成功获得大小为873 bp的粪肠球菌EfaA基因。经IPTG诱导后,获得分子质量约为59 ku的EfaA重组蛋白,以37℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最大。经Western blotting分析发现,具有较好的反应原性。本试验成功构建原核表达质粒pGEX-4T-EfaA,并在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功表达。 相似文献
15.
为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。 相似文献
16.
布鲁菌外膜蛋白及毒力因子研究进展 总被引：2，自引：0，他引：2
布鲁菌细胞膜的基本结构包括脂多糖和外膜蛋白,与细菌的毒力及免疫原性相关。文章描述了布鲁菌外膜蛋白分子结构的最新进展。该菌的外膜蛋白由第一组、第二组和第三组外膜蛋白构成。第一组外膜蛋白对维持布鲁菌外膜蛋白的结构起重要作用;第二组包括36 ku~38 ku外膜蛋白,为膜孔蛋白,由Omp2a和Omp2b基因编码,其中38 ku蛋白基因可能是一个与毒力相关的基因;第三组外膜蛋白包括31 ku和25 ku两个相关的蛋白,具有重要的免疫功能。31 ku蛋白属膜孔蛋白,25 ku蛋白还与毒力有关。文章也介绍了布鲁菌毒力因子研究的最新进展。 相似文献
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猪流行性腹泻病毒LJB/03株的分离及膜蛋白基因的原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Swine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）同属于冠状病毒属的成员，主要引起2周龄仔猪以呕吐、腹泻、脱水为特征的一种急性病毒性传染病，死亡率达100％，已成为世界范围内猪的重要疫病之一。从病毒粒子形态、临床症状、病理变化和流行病学等方面无法区分两种病毒。国内外对两病的防制开展了大量的工作，但对于分子生物学诊断方面研究的较少。传统方法如电镜观察、病毒分离培养等不能有效地将TGEV与PEDV区分开，现代分子免疫学和分子生物学等的进展为新一代生物工程诊断试剂的研制开辟了新途径。 相似文献
18.
本研究旨在获得布鲁氏菌BspD蛋白,制备其多克隆抗体,并分析其潜在生物学功能。根据流产布鲁氏菌（Brucella abortus）2308的BspD基因序列（GenBank登录号：NC_007618.1）获得BspD基因序列,对布鲁氏菌BspD氨基酸序列进行生物信息学分析,然后将目的基因嵌入pMD19-T载体,使用限制性内切酶切下目的基因重组入pET-28a（+）载体,构建pET28a-BspD重组载体,经过双酶切、测序验证后,IPTG诱导表达菌株,SDS-PAGE法鉴定BspD的表达,His标签蛋白纯化柱纯化BspD蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度。用纯化BspD蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体的效价及反应原性。结果表明,成功表达出37 ku BspD蛋白,BCA方法测得纯化BspD浓度为2 000 μg/mL;Western blotting结果显示制备的抗体具有良好的特异性,间接ELISA检测出BspD多克隆抗体的效价为1：12 800,成功制备出BspD多克隆抗体,但其反应原性较低。生物学信息分析得出BspD蛋白具有亲水性,存在跨膜区,无信号肽,有17个磷酸化位点和11个抗原决定簇,BspD蛋白二级结构以α-螺旋为主,达到86.80%,还存在少量延伸链、无规则卷曲、β-折叠等;在线软件Phyre 2构建BspD三级结构证实其多为α-螺旋。以上结果可为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白BspD的功能及分子机制提供参考。 相似文献
19.
本研究旨在通过在Bac to Bac系统中表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的P72基因,为进一步研究P72基因的结构、功能和免疫学特性奠定基础。本研究从含P72全长基因的菌株pGEX-6p-1-P72中扩增出P72基因全序列1941 bp,将扩增的基因连接于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建重组质粒pFastBac HTa-P72,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-P72,再将其转染至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。经Western blotting和夹心ELISA分析,结果表明,P72在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,重组P72蛋白可被特异性兔抗ASFV P72血清、P72单抗识别。结果提示,Bac to Bac系统表达的P72重组蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性,为快速诊断ASF提供良好的候选抗原。 相似文献