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《（《农业科学与技术》）编辑部》2015,(5)
[目的]了解我国猪伪狂犬病病毒流行株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性。[方法]利用Vero细胞从疑似伪狂犬病病毒(PRV)引起的流产死胎猪的脑组织进行病毒分离。通过PCR进行初步鉴定,对分离株g E基因序列进行系统进化树分析以及该病毒对6周龄左右仔猪的致病性试验。[结果]成功分离到1株PRV毒株,命名为PRV N5B株,该病毒能在Vero细胞上增值,在15代TCID50达到107.125/0.1 ml;PCR检测可扩增出特异性条带;g E基因全长1 740 bp,系统进化树分析表明分离株与2012年以来新流行的毒株属于同一个相对独立的分支,核苷酸同源性高达99.7%~100%;而与以往发表的国内外相关序列比较,在2个不同的位置分别有3个连续碱基的插入。动物试验表明,2 ml的该病毒(106/0.1 ml)滴鼻接种能使6周龄左右仔猪100%死亡。[结论]该研究中的PRV N5B分离株g E基因的遗传变异特性以及其对仔猪的致病性试验对于目前流行的猪伪狂犬病的防控及新的疫苗的研发提供理论依据。 相似文献
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为临床上能鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株和疫苗株,根据GenBank中已发表的PEDV疫苗株ORF3基因序列,在245~293位缺失区域两侧设计合成1对特异性引物,建立了快速鉴别和诊断PEDV野毒株和疫苗株的RT-PCR方法,即PEDV野毒株、疫苗株基因组中分别可扩增出长度为282和233bp的特异性片段,而对猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪博卡病毒、猪伪狂犬病毒核酸扩增均为阴性;对PEDV野毒株与疫苗株的最低检测下限分别为455拷贝/μL和396拷贝/μL。该方法不仅能够有效区分PEDV野毒株和疫苗株,而且能够鉴别发病猪的感染情况,为该病的防控提供了有效地技术保障。 相似文献
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参照GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)基因保守序列,设计2对特异引物,通过对最佳反应条件的优化,建立了CSFV和PRRSV的二联RT-PCR检测方法,该方法可同时扩增得到2条与试验设计相符的443 bp(CSFV)和246 bp(PRRSV)特异性条带。应用该二联RT-PCR方法检测猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结果均为阴性,证明该方法有良好的特异性。将已知阳性病毒PCR模板最高稀释倍数作为PCR的敏感度,结果表明该二联RT-PCR体系扩增的敏感度为10-3,可对CSFV和PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。 相似文献
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多重PCR方法快速鉴别猪伪狂犬疫苗毒和野毒 总被引：1，自引：0，他引：1
根据Genbank中PRV的gB、gE、TK基因序列设计并合成引物,对样品中PRVDNA进行多重PCR扩增及反应条件优化,得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为427bp（gB）、298bp（gE）和208bp（TK）。用这3对引物对四种伪狂犬疫苗样品DNA进行多次多重PCR扩增,其中1种疫苗得到与设计相符的1条特异性条带,其余为2条。该结果表明,此检测方法敏感度较高,适用于科学研究、临床诊断以及流行病学调查,对根除伪狂犬病具有重要意义。 相似文献
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为建立一种简便、快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）3种病原的多重PCR方法，针对PRRSVN基因、PPVVP2基因及PRVgp50基因分别合成了1对特异性引物，通过PCR均扩增出分子长377bp、445bp和217bp的DNA条带，与预期扩增片段相符。以3对引物同时对PRRSV、PPV和PRV疫苗株进行多重PCR扩增及反应条件的优化，同时扩增出3条特异性条带。利用所建立的多重PCR方法，对贵州省11个养猪场的40份疑似病料进行检测，结果显示，PRRSV、PPV和PRV的阳性检出率分别为62．5％、17．5％和0％。 相似文献
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《江苏农业学报》2018,(6)
为建立一种快速鉴别猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的方法,根据猪伪狂犬病毒(PRV)全基因序列,并参照SA215、Bartha-K61疫苗株基因缺失位点特征,在单一检测野毒株与疫苗株的基础上,针对g E、g B和TK基因设计引物,首次建立了同时检测猪伪狂犬病毒野毒株与疫苗株的多重PCR检测方法。通过一次PCR检测能区分感染野毒株、疫苗株SA215和Bartha-K61,且与猪圆环Ⅱ型病毒(PCV-2)、细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)无交叉反应。多次试验证明该方法简单、可靠且敏感度高,可用于科学研究和临床诊断等方面。 相似文献
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[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查. 相似文献
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多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究 总被引：3，自引：1，他引：2
根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断. 相似文献
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伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。 相似文献
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根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,研制了检测PRV、PCV-2和PPV的多重PCR试剂盒。该试剂盒扩增的阳性条带分别为300bp、420bp、680bp。敏感性、特异性结果显示,该试剂盒对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV45.2pg/L、PCV-235.7pg/L、PPV0.30ng/L,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、大肠杆菌、猪支原体的扩增结果均为阴性。对125份自然感染病猪样品的检测结果表明,该试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该多重PCR试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV、PCV-2和PPV的检测。 相似文献
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《西南农业学报》2016,(11)
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV变异毒株、经典毒株及弱毒疫苗株的S基因和ORF3基因,设计合成2对特异性扩增引物,用以扩增PEDV S基因和ORF3基因,通过目的片段的数量和片段大小来判断PEDV的毒株类型;通过对退火温度等反应条件的优化,建立了检测不同PEDV毒株类型的多重RT-PCR鉴别检测方法。结果显示,所建立的多重RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV变异毒株、经典毒株和弱毒疫苗株;PEDV变异毒株扩增出2条目的条带,分别为234 bp的ORF3基因片段和826 bp的S基因片段;PEDV经典毒株扩增出1条目的条带,片段大小为234 bp的ORF3基因片段;而弱毒疫苗株扩增出1条目的条带,片段大小为185 bp的ORF3基因片段;与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪乙型脑炎病毒、猪细环病毒及猪细小病毒均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到的最低核酸浓度为2.3×10-4ng/μl;且该方法具有良好的重复性。利用该方法对采集自广西部分地区的91份临床腹泻样品进行检测,样品中PEDV阳性样品有64份,其中变异毒株占89.06%(57/64),经典毒株占4.69%(3/64),弱毒疫苗株占6.25%(4/64)。结果表明,该多重RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原的鉴别诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。 相似文献
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Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒 总被引：4，自引：0，他引：4
选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测. 相似文献
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为了优化猪瘟病毒的RT-nested PCR检测方法,对福建省猪瘟流行情况进行了调查。根据GenBank上发表的猪瘟病毒Shimen株基因序列设计并合成了2对引物,优化了猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的RT-nested PCR检测方法,并对所优化的RT-nested PCR特异性进行了检验。结果表明,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为1×10-7ng/mL,只有CSFV扩增出了272 bp的目的条带,从猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)阳性毒和健康猪脾、肝组织及阴性PK-15细胞均未扩增出特异性条带,说明该方法特异性强。应用此方法对福建省133份病料进行检测,结果有60份病料为阳性,阳性率为45.1%。结果提示优化的检测方法灵敏度高,特异性强;福建省猪群CSFV感染率高,需要加强CSF预防控制工作。 相似文献
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鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立 总被引：13，自引：0，他引：13
[目的]建立一种能区分猪瘟病毒（classical swine fever，CSFV）强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应（RT-nPCR）检测方法。[方法]根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列，选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物，并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物，建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。[结果]应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段，但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0．04pg的CSFV RNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测，结果表明，有14份类似猪瘟强毒，1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。[结论]本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒，减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。 相似文献
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猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鉴别检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】建立猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR快速鉴别检测方法。【方法】根据Gen-Bank中36株猪瘟病毒(CSFV)强毒株和兔化弱毒疫苗株的基因序列,分别设计了针对CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的特异性引物,建立了一种能区分CSFV强毒和兔化弱毒疫苗株的RT-PCR检测方法。【结果】建立的RT-PCR检测方法可以从CSFV强毒株和兔化弱毒疫苗株中分别扩增出大小为187和492 bp的特异性片段,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪源性病毒的检测结果均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。对10份疑似猪瘟临床样品进行检测后发现,利用该方法可以从中分别检测出CSFV强毒和疫苗毒。【结论】建立了可鉴别检测CSFV强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR方法,为猪瘟的早期诊断及疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别提供了技术参考。 相似文献
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【目的】建立一种能够应用于临床样本猪瘟病毒(CSFV)检测的快速、简便且标准化程度高的检测技术,以满足畜牧业生产和兽药市场的需求。【方法】根据GenBank中猪瘟病毒及近源病毒的基因组全序列,选择特异保守区域设计了2对猪瘟病毒引物,借助3′端引物碱基错配对PCR扩增效率的影响,优化筛选了能够鉴别猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒疫苗的PCR退火温度,经多重试验组合建立了一套鉴别猪瘟强毒和弱毒的多重RT-PCR鉴别诊断方法。【结果】扩增反应条件的确定试验表明,退火温度为55℃;特异性分析表明,从弱毒C株和石门强毒株的基因组中分别扩增出1条大小为492和178 bp的特异性片段,从强弱毒株混合物中1次扩增出2条大小为492和178 bp的特异性片段,检测不到伪狂犬病病毒的RNA;敏感性分析表明,该方法能检测出0.8 pg的猪瘟病毒RNA;应用试验表明,8份疑似猪瘟病料中5份为强毒感染,2份为弱毒感染,1份为弱毒和强毒的混合感染。【结论】研究建立的多重RT-PCR方法具有敏感性、特异性强、重复性好的特点,对养猪业的发展具有十分重要的意义。 相似文献
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陕西省猪伪狂犬病流行病学调查和WG株的分离鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
应用gE-EL ISA法对陕西省部分地区6个集约化猪场的187份猪血清进行了伪狂犬病毒(P seu-dorab ies v irus,PRV)野毒感染检测,并对疑似伪狂犬病发病仔猪的内脏及脑组织进行了病毒分离鉴定。结果显示,陕西省猪PRV野毒抗体平均阳性率为28.76%,最高为48.98%,最低为0;分离毒株可致PK-15细胞出现典型的圆缩、集聚,脱落等细胞病变,连续传代后,CPE出现的时间稳定在20 h左右;细胞培养物和病料混悬液接种家兔均出现典型奇痒症状,PCR反应扩增出PRV gE基因中长度为612 bp的特异性片段。表明本试验分离的病毒为PRV,并将其命名为PRV W G株。 相似文献
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为了解猪伪狂犬病毒(PRV)g E基因的遗传变异特性,根据Gen Bank已发表的PRV g E全基因序列,设计并合成1对特异性引物,对PRV YZ株进行了g E全基因的扩增、克隆及测序,并与其他参考毒株g E基因进行比较序列分析。测序结果表明,YZ株g E全基因序列由1 862bp组成,与Gen Bank已发表的13株PRV g E参考株序列同源性介于97.9%~99.9%。进化树分析表明,YZ株与目前国内流行的毒株在同一进化分支内,与国外分离株有一定差异。 相似文献