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1.
布鲁菌是一种重要的人畜共患病病原,兼性胞内寄生,无典型毒力因子,毒力相关基因的研究对阐明布鲁菌持续感染的机制具有重要意义。本研究以流产布鲁菌S2308为亲本株,通过同源重组的方法,构建流产布鲁菌LysR家族转录调控子基因bab＿RS24670缺失株ΔlttR8,基于广宿主质粒pBBR1MCS构建成互补株ΔlttR8-Com。免疫印迹试验表明：ΔlttR8为光滑型菌株;体外培养分析发现lttR8缺失不影响布鲁菌的生长;细胞感染试验发现lttR8缺失不影响布鲁菌黏附、入侵细胞和胞内存活的能力。耐受性试验分析发现：lttR8缺失不影响布鲁菌对过氧化氢（H2O2）和多粘菌素B(polymyxin B)的敏感性。小鼠感染试验分析发现lttR8缺失显著减弱流产布鲁菌的毒力。综上所述,本研究发现一个新的与流产布鲁菌致病性相关的转录调控子,为布鲁菌致病机制研究提供参考。 相似文献
2.
《中国兽医学报》2019,(2):260-264
为提高布鲁菌疫苗株的免疫保护效果,本试验以牛布鲁菌疫苗株S19为研究对象,将羊布鲁菌Omp31基因克隆、扩增并插入至广宿主质粒pBBR1MCS-2中,构建重组质粒pBBR1MCS-Omp31;通过电转化的方式转入S19感受态细胞中,经抗性基因筛选和PCR验证,获得重组牛布鲁菌S19-Omp31株;该重组菌株连续传25代未发现重组质粒和Omp31基因丢失,表明其遗传稳定性良好;进一步经SDS-PAGE检测可见约26 000相对分子质量的目的条带,采用Western blot法检测显示目的蛋白可与His单克隆抗体及Omp31蛋白高免血清反应。本研究构建的重组牛布鲁菌S19-Omp31株能够稳定表达目的基因,为进一步开展S19-Omp31株的免疫效果评价奠定基础。 相似文献
3.
现有的布鲁菌减毒活疫苗存在一定毒力,且野强毒株和减毒活疫苗株间缺少可供鉴别的抗原,导致在血清学检测上自然感染与疫苗接种很难区分,限制了现有的减毒活疫苗的广泛应用.本文拟对布鲁菌的减毒活疫苗株S2进行遗传改造,克服上述缺陷.本研究利用同源重组的方法,得到了布鲁菌S2株omp10基因缺失株.分别用基因缺失株和疫苗株感染小鼠,比较基因缺失株小鼠体内的存活能力.结果成功构建了布鲁菌S2株omp10基因缺失株,动物试验结果表明,基因缺失株仍能在小鼠体内存活,具备作为减毒活疫苗的特性.与原始S2株比较,基因缺失株的感染力进一步减弱.表明omp10基因在布鲁菌的毒力及体内生存方面发挥了作用,为基因标记疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
4.
试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。 相似文献
5.
为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63-887基因缺失株(16MΔDK63-887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63-887基因,获得突变株16MΔDK63-887。将亲本株16M、疫苗株M5-90、突变株16MΔDK63-887在相同条件下振荡培养,观察其生长趋势变化;将各菌株置于不同外界环境中,观察其生存率;将各菌株侵染小鼠巨噬细胞,比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT-qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63-887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16MΔDK63-887在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株;侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降;RT-qPCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P0.01),结果表明,布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。 相似文献
6.
【目的】 试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】 利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1 800 V电压、400 Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】 试验成功获得片段大小为522、539、1 054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】 本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 相似文献
7.
为探究内化素inlA、inlB基因缺失对单核细胞增生性李斯特菌(LM)生物学特性的影响,本研究采用同源重组技术构建了inlA基因缺失株(LM90-inlA)和inlB、inlA双基因缺失株(LM90-ΔinlB/ΔinlA),并对其生物学特性进行了初步研究。结果显示:PCR和测序结果证实成功构建了目的基因(inlA、inlB)缺失株;菌落PCR和测序结果显示2种缺失株在体外连续培养20代过程中均能稳定遗传;生长特性实验表明2种缺失株与亲本株生长差异无统计学意义(t_(LM90/LM90-ΔinlA=0.34),p0.05;t_(LM90/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.324,p0.05;t_(LM90-ΔinlA/LM90-ΔinlB/ΔinlA)=0.008,p0.05)且inlA缺失后2缺失株对小鼠的LD_(50)分别升高了0.64、1.26个对数数量级。研究结果表明inlA基因和inlB基因对LM90的部分生物学特性具有一定的调控作用,这对于阐明LM毒力因子的致病机理提供了参考依据,也为研究内化素介导LM穿越血脑屏障(BBB)的作用机制奠定了科学基础。 相似文献
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试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。 相似文献
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应用PCR扩增羊布鲁菌M5-90株基因组DNA,得到大小为753 bp的Bp-26基因,将其克隆入pMD20-T载体上,测序正确后,构建重组质粒pET-28a-Bp-26,转化到大肠埃希菌BL21 (DE3)中,经IPTG诱导其表达,用Western blot鉴定蛋白.结果表明,成功构建了pET-28a-Bp-26原核表达载体,并在E.coliBL21中表达Bp-26基因,为开展羊布鲁菌Bp-26目的蛋白的抗原性分析和功能研究奠定了基础. 相似文献
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本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
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旨在探究单增李斯特菌溶血素S/O(LLS/LLO)对单增李斯特菌(LM)的部分生物学特性影响及单增李斯特菌溶血素S/O基因缺失株的免疫原性。利用同源重组技术在本实验室已成功构建并保存的LM90SB2Δlls菌株基础上构建LM90SB2Δlls-Δllo,并绘制LM90SB2和LM90SB2Δlls-Δllo的生长曲线，测定半数致死量(LD50)、组织载菌量(同时采用灌服和腹腔注射方式)等，进行小鼠免疫保护性研究，分析溶血素基因llsB/hly缺失对LM的生长特性以及毒力的影响。结果：成功构建LM90SB2Δlls-Δllo缺失株，且能在体外稳定遗传。测定生长曲线，LM90SB2的生长活性略高于LM90SB2Δlls-Δllo; LM90SB2的LD50为3.65×107.23 CFU,LM90SB2Δlls-Δllo的LD50大于2.7×109 CFU;通过灌服及腹腔注射，与LM90SB2相比，LM90SB2Δlls-Δllo在小鼠脑、肝、脾中的载菌量均明显减少，差异极显著(P... 相似文献
12.
《中国畜牧兽医》2019,(11)
本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd~+的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493)构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸(DAP)阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430(pYA-gfp),对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430(pYA3493),能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。 相似文献
13.
《中国兽医学报》2016,(12):2086-2089
为了解羊种布鲁菌内蒙古分离株和疫苗株的遗传变异情况,对羊种布鲁菌分离株B1、B2、B3、B4以及疫苗株M5、S2、A19的bp26及omp10基因进行了扩增、克隆和序列分析,并与国内外的代表性毒株进行了序列比对。结果显示:4株分离株的bp26序列长度均为900bp,开放阅读框为753bp,与疫苗株M5同源性为100%,疫苗株S2和A19的同源性为99.99%;分析发现所有序列中共有4处变异,A19 bp26基因的CDS区第304位A→G和第405位C→T突变,S2 bp26基因的第498位C→T和727位G→A突变;其中304位的A→G的变异导致其编码的氨基酸发生了从天冬酰胺(N)到天冬氨酸(D),727位G→A的变异导致氨基酸发生了缬氨酸(V)到异亮氨酸(I)的变化;而分离株和疫苗株M5未发生变异。4株分离株的omp10序列长度均为513bp,开放阅读框为396bp,同源性为99.99%,与疫苗株S2和A19同源性为100%;分析发现疫苗株M5的omp10基因序列发生了1处变异,第144位C→T,但没有引起氨基酸改变,其他菌株没有发生变异。 相似文献
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通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。 相似文献
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为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。 相似文献
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为探究鸭疫里默氏杆菌(RA) IX型分泌系统(T9SS)分泌的假定蛋白AS87＿05150的功能,本研究采用自杀质粒同源重组的方法构建RA Yb2株AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150及其回补株cYb2Δ5150,经PCR及测序鉴定,结果显示AS87＿05150基因缺失株Yb2Δ5150和回补株cYb2Δ5150均正确构建,缺失株的表型为16S r RNA+AS87＿05150 ORF-,回补株的表型为16S r RNA+AS87＿05150 ORF+。采用荧光定量PCR (qPCR)检测Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株AS87＿05150基因的转录水平;根据上述3株菌不同时间的OD600nm值绘制各菌株的生长曲线;采用微量结晶紫法检测各菌株生物被膜(BF)的形成能力;将107 cfu/孔的Yb2、Yb2Δ5150和cYb2Δ5150株分别感染Vero细胞,检测各菌株对Vero细胞的黏附和侵袭力。q PCR检测结果显示,cYb2Δ5... 相似文献
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【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失... 相似文献
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《中国兽医学报》2016,(8):1358-1362
为找出布鲁菌疫苗株S2基因组分泌性蛋白、参与生物学途径基因、细胞组件基因、分子功能基因、毒力相关因子及耐药基因,对布鲁菌疫苗株S2全基因组测序并进行Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测、GO注释、VFDB注释、ARDB注释。全基因组测序结果表明,S2基因组大小约为3.3 Mb,杂合度和重复度较低,GC含量分布未出现异常。通过Ⅲ型分泌系统效应蛋白预测未找出S2分泌性蛋白。通过GO数据库注释,发现参与生物学途径基因有3 823个、细胞组件基因有1 949个、分子功能基因有2 585个。通过VFDB数据库注释,找出S2基因组有79个毒力相关基因,其中最大基因为8 604bp,最小基因为180bp。通过ARDB数据库注释,找出S2基因组有13个耐药基因,最大基因为3 225bp,最小基因为333bp;其中功能注释的有GL002835基因,是枯草杆菌肽类基因,此基因耐受抗微生物类药物。本研究为进一步了解布鲁菌S2基因组基本功能奠定了基础。 相似文献
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根据Gen Ban K中发表的多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.multocida)HN06株(登录号为NC017027)的omp H核苷酸序列设计合成一对特异性引物,将PCR扩增获得的牦牛源P.multocida C47-8的omp H基因片段连接到p MR10载体上,构建了C47-8株Δomp H缺失株互补质粒p MR10-Δomp H,并将该质粒电转化至C47-8Δomp H缺失株中,成功获得其互补菌株。在此基础上,对C47-8亲本株、Δomp H缺失株以及互补株的生物学特性进行研究。形态学观察结果表明,3株菌的生长形态无差异;生化试验结果表明,除了缺失株发酵蕈糖、硝酸盐试验呈现阳性外,3株菌的其余生化特性未发生改变;体外生长曲线表明亲本株C47-8的生长速度比缺失株和互补株的生长速度慢,说明omp H基因对C47-8的生长有显著影响。本试验为深入研究P.multocida的致病机制以及研制安全有效的基因缺失减毒活疫苗奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同... 相似文献