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1.
中国巴马小型猪封闭群内源性反转录病毒存在状况分析 总被引：4，自引：0，他引：4
检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus;PERV);PERV)在中国巴马小型猪封闭群中的携带情况.根据本实验室已建立的PCR、RT-PCR检测方法,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(p0l)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测;同时根据目前通用的env基因分型方法检测PERVenv-A、env-B、env-C的存在与表达情况.所有被检样品不仅存在PERV gag、pol、env特异性DNA,而且都能够转录为RNA;所有样品同时存在PERV A、B亚型的前病毒,且有70%个体还同时存在PERV-C亚型前病毒,但仅有90%样品检测到PERV-A亚型的表达,50%检测到PERV-B亚型的表达,而所有的样品均未检测到PERV-C型的表达.巴马小型猪封闭群外周血淋巴细胞基因组中存在PERV-A、B、C 3种亚型,但仅有A、B两种亚型能够表达.PERV-A、B、C 3种亚型的同时存在,预示着巴马小型猪封闭群中存在不同亚型病毒重组的可能性. 相似文献
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根据猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag)基因、多聚酶(pol)基因、囊膜(env)基因和β-肌动素(β-actin)基因核酸序列设计并筛选特异性引物6对,利用PCR方法对五指山小型猪PERV gag、pol和env基因存在情况进行系统检测;利用半定量RT-PCR方法对五指山小型猪PERV gag、pol和env基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉7个组织中的表达情况进行系统检测与分析.结果显示,在202个被检样品中,gag、pol基因和envB基因亚型均存在,envA基因亚型仅3个样品未发现,envC基因亚型共检出34个,检出率为16.8%.所测试的7个组织均表达gag、pol和env基因序列,但envC仅在1头个体的组织中表达.各组织gagmuRNA丰度以肾脏为最高,其次为肺、心、肝、脾,脑和肌肉组织的丰度最低.各组织pol mRNA丰度以肾脏为最高,其次为脾、肺、肝、心,肌肉和脑组织的丰度最低.各组织envA、envBmRNA丰度信号强度分布与gag、pol信号类似,亦以肾脏为最高,脑和肌肉组织的丰度最低.各组织envC mRNA的信号强度明显低于envA、envB.以上结果表明,在五指山小型猪中存在PERV,且在各组织中的表达量有差异. 相似文献
3.
聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒 总被引：5，自引：0，他引：5
为了建立检测猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法，根据巳发表的PERV的序列，设计并合成了针对PERV核心蛋白（gag）、多聚酶（pol)、囊膜蛋白（env）基因的3对引物，预期扩增片段分别为361、150、265bp。应用PCR技术检测了PERV在4株猪源细胞中的整合情况。结果表明，在所有被检细胞的基因组中均存在有PERV的前病毒序列，应用RT-PCR检测上述4株猪源细胞中PERV特异性MRNA的表达，结果均为阳性。试验还对建立的上述2种方法的特异性进行了探讨，结果表明试验建立的PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究PERV奠定了基础，还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。 相似文献
4.
根据猪内源性逆转录病毒（PERV）的核心蛋白（gag）基因、多聚酶（pol）基因、囊膜（env）基因和β-肌动素（β-actin）基因核酸序列设计并筛选特异性引物6对,利用PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因存在情况进行系统检测;利用半定量RT-PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉7个组织中的表达情况进行系统检测与分析。结果显示,在202个被检样品中,gag、pol基因和envB基因亚型均存在,envA基因亚型仅3个样品未发现,envC基因亚型共检出34个,检出率为16.8%。所测试的7个组织均表达gag、pol和env基因序列,但envC仅在1头个体的组织中表达。各组织gag mRNA丰度以肾脏为最高,其次为肺、心、肝、脾,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织pol mRNA丰度以肾脏为最高,其次为脾、肺、肝、心,肌肉和脑组织的丰度最低。各组织envA、envB mRNA丰度信号强度分布与gag、pol信号类似,亦以肾脏为最高,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织envC mRNA的信号强度明显低于envA、envB。以上结果表明,在五指山小型猪中存在PERV,且在各组织中的表达量有差异。 相似文献
5.
利用CDNA末端快速扩增技术（RACE）成功扩增了广西巴马小型猪近交系连续4代次及封闭群的猪内源性反转录病毒（PERV）3UTR,共获得8条序列（GenBank登录号分别为：GQ475493、GQ475494、GQ475495、GQ475496、GQ475497、GQ475498、GQ475499、GQ475500）,分为638、749bp 2种不同的类型,都属于PERV-A亚型。以PERV-3UTR构建遗传进化树,PERV-A,B,C分群清晰,3UTR可作为PERV亚型区分的另一基因序列。对调控元件定位分析,推测具有749bp类型3UTR的PERV病毒转录水平更高。在所获得序列的209～227bp位置,发现了＂CTTGAAACTT＂10个碱基的1.9个重复。模拟RNA二级结构,广西巴马小型猪PERV-3UTR 2种类型无论从空间构型、自由能,还是茎环数量都存在明显的不同。这些结果为全面评价广西巴马小型猪来源的PERV病原安全性提供了参考。 相似文献
6.
作者介绍了国内外猪内源性反转录病毒（PERV）研究进展,简述了中国不同品种小型猪PERV存在情况、PERV前病毒全基因克隆与序列分析、细胞水平鉴定方法、感染HEK293细胞研究平台的创建、猪A3F对PERV的抑制作用研究,以及从分子遗传学上揭示不同品系PERV特异性等创新性研究成果,分析了五指山小型猪近交系具有PERV基因拷贝少且没有PERV-C等特异性,以及展望培育中国PERV阴性猪新品系方法等研究,以期为人类异种器官移植和生物医用材料产品安全性研发,解决小型猪PERV疾病传播危险性提供科学对策和新的方向。 相似文献
7.
《中国兽医学报》2020,(10)
检测不同代次广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV)感染HEK293细胞模型(HEK293-PERV-BM)中,HERV-W各基因mRNA和syncytin-1蛋白表达水平,以及HERV-W各基因变异情况,评价PERV的整合对HERV-W的影响。结果显示,与HEK293细胞相比,PERV整合后,不同代次HEK293-PERV-BM中HERV-W gag、pol、env和syncytin-1的mRNA相对表达量出现不同程度的改变,且改变趋势相似,即P10或P20后开始升高,至P30最高;选取相对表达量差别较大代次,检测其syncytin-1蛋白,各代次间syncytin-1蛋白表达量的改变较mRNA的差别小。此外,PERV整合后,在P1～P55中HERV-W结构基因仅发生个别位置的点突变,未见发生固定位置的点突变或基因片段的缺失、插入及重组。本试验为系统评价PERV-BM在异种器官移植中的安全性提供参考。 相似文献
8.
以巴马小型猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染HEK293细胞模型(PERV-BMHEK293)为研究对象,分析PERV整合对HEK293细胞活性的影响,同时建立7种与人细胞增殖和周期调控密切相关基因的实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法,并对细胞感染模型中7个基因的mRNA表达情况进行分析。细胞活力分析结果显示,随着培养代次及培养时间增加,相对于母源HEK293细胞PERV感染模型的细胞活力下降;qPCR检测方法建立结果显示,所构建的cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、c-myc、p53、p16基因检测方法检测各基因在1.0×10~1~1.0×10~9 copies/μL反应范围内有很好的线性关系,扩增产物熔解曲线只出现特异性单峰,各组内变异系数在0.31%~2.01%之间,组间变异系数在0.46%~2.19%之间,重复性好,可稳定地用于相关基因mRNA的定量检测。用建立的q-PCR检测方法对PERV感染模型进行细胞周期调控相关基因mRNA表达分析,结果显示,与母源细胞相比,模型细胞cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、p53和p16基因的mRNA表达无明显变化,原癌基因c-myc基因表达下调,提示PERV感染可能抑制c-myc基因表达。该研究结果可为评价巴马小型猪来源PERV在人-猪异种移植中生物安全性提供参考。 相似文献
9.
首先将巴马小型猪（BM）、巴马香猪（BMXZ）外周血淋巴细胞分别与G418抗性HEK293细胞（G418^R293）共培养，通过G418加压筛选，除去共培养体系中巴马小型猪、巴马香猪外周血淋巴细胞，然后应用PCR及RT-PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果经6周共培养及3周加压筛选后，细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化；PCR及RT-PCR鉴定表明，筛选后的共培养体系中已没有巴马小型猪、巴马香猪外周血淋巴细胞的存在；PERV特异性检测方法检测显示，该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。从而证实了猪外周血淋巴细胞来源的PERV在体外也能够感染人源细胞系，为研究PERV的生物学特性及病原安全性的评价搭建了技术平台。 相似文献
10.
《中国兽医学报》2020,(5)
检测广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV)整合到HEK293细胞基因组(HEK293-PERV-BM)后,宿主细胞的细胞周期、细胞凋亡及cyclin D1、CDK4、c-Myc、p53、p16和k-Ras等相关基因表达的改变,推测相关作用机制。检测发现P10代巴马小型猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型(HEK293-PERV-BM)的细胞周期主要被阻滞在S期和G2/M期,细胞凋亡受到抑制,P25代细胞周期主要被阻滞在S期,细胞凋亡明显受到诱导。通过实时荧光定量PCR和Western blot检测发现细胞周期相关基因的表达与细胞感染模型传代次数(P1～P35)有密切关系,其中cyclin D1、c-Myc和k-Ras基因表现为先降低后升高,而CDK4和p16基因则恰好相反,同时,p53基因表达的改变不明显,据此可以推测P10代细胞周期的改变可能由Rb调控通路诱导发生,P25代细胞周期的改变可能由Rb调控通路与p53调控通路协同诱导发生。上述结果提示PERV的感染可能存在潜在的危险。 相似文献
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Wu J Ma Y Lv M Yang Y Guo Y Yu X Tian K Zhang J 《Comparative immunology, microbiology and infectious diseases》2008,31(4):367-371
We conducted a large-scale survey on the existence and expression status of porcine endogenous retrovirus (PERV) in seven breeds of Chinese miniature pigs. Genotyping of PERV was examined by PCR using type-specific primers according to the env genotyping method. The presence and expression status of viral gag, pol and env genes were further analyzed in Wuzhishan pigs (WZSP) and Bama minipigs (BMP). The results showed that PERV existed in all 348 genomic DNA samples. The genotype distribution was subtype A-74.43%, subtype B-95.40% and subtype C-30.46%. No expression of subtype C was found in WZSP and BMP. This research obtained an adequate level of information on the molecular epidemiology of PERV in China. The results indicated that it is possible to monitor pig herds for individuals with the lowest PERV prevalence, especially lacking PERV-C. 相似文献
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The paper is a brief introduction of porcine endogenous retrovirus (PERV) innovative research results in the world and also expounds the passing PERV existence situation on different varieties of miniature pig, analyzes the PERV-virus gene cloning and sequence, appraises method on cell level, create the platform of infection HEK293 cells research, study on pigs A3F inhibition of PERV, and reveal the innovative research results on the specific molecular genetics in the different strain of PERV, analyzes the advantages of Wuzhishan miniature pig inbred line such as low gene copy of PERV,and there is no passing PERV-C specificity and as well as looking forward to cultivate the methods for new strain of PERV negative pigs. It will provide a scientific counter measure and new perspective to solve the spread of disease risk of miniature pig PERV and product safety for human xenotransplantation and biomedical materials of research and development. 相似文献
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Expression of porcine endogenous retroviruses (PERVs) in melanomas of Munich miniature swine (MMS) Troll 总被引：1，自引：0，他引：1
Dieckhoff B Puhlmann J Büscher K Hafner-Marx A Herbach N Bannert N Büttner M Wanke R Kurth R Denner J 《Veterinary microbiology》2007,123(1-3):53-68
Porcine endogenous retroviruses (PERVs) are integrated in the genome of all pig breeds. Since some of them are able to infect human cells, they might represent a risk for xenotransplantation using pig cells or organs. However, the expression and biological role of PERVs in healthy pigs as well as in porcine tumours is largely unknown. Since we and others have recently shown overexpression of a human endogenous retrovirus, HERV-K, in human melanomas, we studied the expression of PERVs in melanomas of selectively bred Munich miniature swine (MMS) Troll. This breeding herd of MMS Troll is characterised by a high prevalence of melanomas, which histologically resemble various types of cutaneous melanomas in humans. Several genetic factors have been defined when studying inheritance of melanomas and melanocytic nevi in MMS Troll. Here we show that the polytropic PERV-A and PERV-B as well as the ecotropic PERV-C are present in the genome of all melanoma bearing MMS Troll investigated. Most interestingly, in the spleen, but not in other organs, recombinant PERV-A/C proviruses were found. PERV expression was found elevated in melanomas when compared to normal skin and viral proteins were expressed in melanomas and pulmonary metastasis-derived melanoma cell cultures. During passaging of these cells in vitro the expression of PERV mRNA and protein increased and virus particles were released as shown by RT activity in the supernatant and by electron microscopy. Genomic RNA of PERV-A, -B and -C were found in pelleted virus particles. Although PERV expression was elevated in melanomas and pulmonary metastasis-derived cell cultures, the function of the virus in tumour development is still unclear. 相似文献
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猪内源性逆转录病毒对异种组织器官移植影响的研究进展 总被引：1，自引：0，他引：1
猪内源性逆转录病毒(Porcine en-dogenous retrovirus,PERV)是新发现的对人细胞具有感染性的且存在于正常猪体内的病毒,在异种组织器官移植过程中可能向人传播,直接威胁到接受移植者的健康甚至生命,这是异种组织器官移植首要克服的难题。由于PERV近年来才受到广泛关注,所以人们对PERV的分类,对人类和其他动物的危害性及病原的检测均不能完全确定。文章旨在提供上述几方面的研究现状,以期为PERV的深入研究奠定基础。PERV能影响移植受体的生殖,抑制受体免疫体系;对其他物种的细胞或活体都可能产生体外和体内感染性;目前有多种PERV检测方法,为受体和供体的病毒监控提供了依据。 相似文献
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荣昌猪是我国优良地方品种,巴马香猪和贵州小型香猪为我国独特小型猪品系。本研究采用美国猪基因组协作计划推荐的19个微卫星标记对荣昌猪、荣昌猪B系、巴马香猪、贵州小型香猪及外来猪种大白猪进行了遗传学检测和分析。结果表明:19个微卫星位点在群体中均表现为多态,每位点等位基因数10~23个。5个猪种中荣昌猪B系的遗传多样性最高,荣昌猪次之;2种小型猪的遗传多样性较低,其中巴马香猪的等位基因数(121个)略大于贵州小型香猪(114个),但其遗传多样性指数(平均期望杂合度0.6535±0.0347)小于贵州小型香猪(0.6919±0.0227),反映了巴马香猪较低的基因杂合度和较小的遗传变异;大白猪的遗传多样性最低。从品系的共有等位基因来看,荣昌猪B系基因背景组成中其亲本品系荣昌猪所占比例(30.22%)要大于大白猪(24.37%);大白猪和其他4个猪群体的共享等位基因数均较低(21.24%~25.12%);巴马香猪和贵州小型香猪之间共有等位基因数最高(45.06%)。采用基于遗传距离的NJ法和基于基因频率的最大似然法进行系统聚类,除了大白猪明显为独立分支及荣昌猪B系表现出较远的聚类关系外,其他3个猪种间的聚类有所不同。 相似文献
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为了丰富广西巴马小型猪细胞因子生物学数据,本试验采取广西巴马小型猪的外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR扩增,将克隆出的与目的基因大小相符的片段回收,再与T载体连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆,将重组菌测序后提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性,并利用软件对克隆序列进行分析。结果表明,已克隆出的巴马小型猪细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α基因序列长度分别为338、377、380、402 bp,测序结果均与目的基因预期估计值吻合。序列分析结果发现与已知的家猪或野猪的相应基因同源性较高,IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α序列同源性分别为98.9%、99.5%、99.2%、100%。研究巴马小型猪细胞因子基因序列不仅丰富了生物学数据,而且为细胞因子的功能研究提供了依据,也为细胞因子的定量检测奠定了基础。 相似文献