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根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性,以不改变氨基酸序列为原则,对源于蜡样芽孢杆菌M22（Bacillus cerues M22）的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成新的基因序列Mn-SOD-2。构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体。结果表明,所构建的酵母工程菌株YM103,经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量为24kD,与预期大小一致。酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好。 相似文献
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根据毕赤酵母(Pichia pastons)密码子的偏好性,以氨基酸序列不变为原则,对源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cernes)M22的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成了新的基因序列Mn-SOD-2.构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体.结果表明,所构建的重组体经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰单一活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量24 kD.酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好. 相似文献
3.
抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化 总被引：1，自引：0，他引：1
用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽cecropinA(1-8)-melittin(1-18)基因片段,合成片段与酵母表达载体pPIC9K重组,构建胞外分泌表达载体pPIC9K-came,电击法转化毕赤酵母(Pichiapastoris)SMD1168宿主菌,对CAME抗菌肽重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,酵母表达抗菌肽具有抗菌活性且溶血活性显著降低;重组酵母在含2%葡萄糖pH7.0的YPD培养液中,250r/min震荡培养24h后,重组酵母菌的A600为6.0时,经0.5%甲醇在28℃条件下诱导48h能够诱导产生较高抗菌活性的抗菌肽。 相似文献
4.
牛γ-干扰素在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达及抗病毒活性比较** 总被引：2，自引：0，他引：2
用RT-PCR从经ConA刺激的荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增了BolFN-γ基因，克隆人pGEM T-easy载体测序。再亚克隆其成熟肽基因，分别构建大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET28a／BolFN-γ和毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPICZα／BolFN-γ前者存Ecoli BL21中经IPTG诱导实现了高效表达，表达蛋白占菌体总蛋白的30％，表达产物以包涵体形式存；后者存P. pastorisGS115中经甲醇诱导实现了高效分泌表达，表达产物直接分泌到培养上清中，表达量约为1．0g／L。分别在CEF／VSV和MDBK／VSV细胞系上对2种表达蛋白的抗病毒活性进行了比较，结果表明，两种重组蛋白在MDBK／VSV抗病毒活性高于在CEF／VSV上的活性，而毕赤酵母表达的蛋白抗病毒活性高于大肠杆表达蛋白，约为前者的2倍。 相似文献
5.
抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法. 相似文献
6.
马铃薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因(sAGP)的克隆及其在毕赤酵母中的表达 总被引：3，自引：0，他引：3
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选用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）系统表达特异性抗速灭威单链抗体（scFv）基因,以为速灭威特异性抗体的大量制备奠定基础。设计引物扩增阳性克隆scFv基因,亚克隆至表达载体pPICZαC,获得重组酵母表达质粒pPICZαC-scFv,线性化pPICZαC-scFv并高效电转P.pastoris（X-33）,对转化子进行抗性梯度筛选得到一株高效表达的X-33-Pp-SMW-12-6菌株。对获得的菌株先后进行表达条件的优化、优化条件下的诱导表达及单链抗体性质研究。结果表明：P.pastoris-scFv的质量接近其亲本E.coli-scFv的质量,X-33-Pp-SMW12-6在优化条件下的表达产量达28mg/L,比未优化前的产量提高了约8mg/L,经纯化后抗体纯度可达85%以上。因此,利用P.pastoris表达系统制备抗速灭威单链抗体比细菌表达系统更有效、更经济。 相似文献
8.
巴斯德毕赤酵母分泌表达载体pPICINU是利用来源于克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因信号肽DNA序列（ISP）构建的。表达实验结果表明，带有分泌表达载体pPICINU的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌，具有与带有表达载体pPIC9K(带有α因子信号肽）的β-1，3－1，4葡聚糖酶基因重组菌相同的分泌效率。 相似文献
9.
里氏木霉木聚糖酶基因Ⅱ在毕赤酵母中的分泌表达及其酶学性质研究 总被引：1，自引：0，他引：1
利用RT-PCR技术从高产木聚糖酶菌株T. reesei Rut C-30中成功扩增出其主要木聚糖酶基因XynⅡ,经序列分析证实,在该菌株诱变选育过程中其成熟肽序列有两处碱基发生突变;将不带原基因信号肽的XynⅡ克隆到毕赤酵母高效表达载体pPICZαA上,线性化后经电击转化到毕赤酵母中,经Zeocin及PCR筛选后得到的转化子用1%甲醇诱导。SDS-PAGE证实,重组子实现了分泌表达,且发酵上清中几无杂蛋白;对该重组酶酶学性质分析表明,该酶最适反应温度为60℃,最适反应pH值为6.0,该酶热稳定性较好,在50℃下保温30 min仍能保留其95%以上活性。 相似文献
10.
采用PCR定点诱变技术,将家蝇防御素抗菌肽成熟肽段的基因（des-hf gene）倒数第九个氨基酸由甘氨酸（G）突变为带正电荷的精氨酸（R）,构成第一个突变体des-hf-MU1。采用同样的方法在des-hf 基因的C端加上六个带有正电荷的赖氨酸（K）,构成第二个突变体des-hf-MU2。采用毕赤酵母表达系统对上述两个突变体进行表达,抗菌特性表明表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,根据琼脂孔扩散法检测des-hf-MU1和des-hf-MU2的抑菌效价比des-hf分别提高了2.4倍和8.0倍,且在PH值为5～6时活性最高,热稳定性实验显示des-hf-MU1、des-hf-MU2 100 ℃加热10min 后仍具有抑菌活性,这些充分显示了良好的应用前景。 相似文献
11.
根据GenBank中报道的猪抑制素基因序列设计两对引物，克隆含有抑制素抗原决定簇基因片段α(1～32)的p1INH和p2INH，在这两个片段中都设有限制性内切酶XbaⅠ的酶切位点，通过XbaⅠ把p1INH与p2INH串联起来。串联抑制素基因片段与pcDNA3.1载体通过EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点连接后经过转化DH5α感受态细菌构建重组载体。以重组载体作为模板，以含有EcoRⅠ、HindⅢ酶切位点的引物PCR，产物经验证为含串联的抑制素基因。串联的抑制素基因产生的融合蛋白具有抑制素的免疫原性，也不会与体内其他蛋白发生免疫交叉反应。串联后的基因片段在单位体积内的抗原位点数增多，免疫效果也会加强。可以反馈性地抑制FSH的分泌，提高母畜的排卵数，提高产仔数。 相似文献
12.
摘要：α溶血素（α-Hemolysin, α-HL）是金黄色葡萄球菌的主要毒力因子之一，利用PCR技术从金黄色葡萄球菌临床分离株扩增出编码α溶血素的基因(α-HL)，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达质粒pET32a+-α-HL。经诱导表达后，进行SDS-PAGE分析，结果表明:α-HL在大肠杆菌中已融合表达,融合蛋白的分子量为53kD。溶血实验证明该融合蛋白具有较强的溶血作用,其溶血效价达2.26×104 HU/mg,表明表达产物具有生物活性,这为进一步研究其致病与免疫机理、疫苗设计提供了条件。 相似文献
13.
以ConA刺激的犬外周血淋巴细胞总RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增出犬IL-2成熟蛋白基因，将目的片段连接到pMD18-T载体，测序结果显示，扩增片段与GenBank上发表的序列一致。然后将目的片段连接到酵母表达载体pPICZa-A上，得到重组酵母犬IL-2表达载体pPICZaA-CaIL-2，经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR方法筛选重组酵母菌，甲醇诱导表达，SDS-PAGE结果显示表达上清中有大小约20kDa的目的条带，比实际分子量略大，推测蛋白可能发生糖基化。MTT法测定生物学活性结果表明，重组犬IL-2能够极显著促进犬外周血淋巴细胞增殖。证明酵母表达的犬重组IL-2具有良好的生物学活性。 相似文献
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实验克隆了莱航鸡(Gallus gallus )MHC I α (BF2)(GenBank登陆号：AY989897)全基因，分析了其信号肽序列，构建了缺失信号肽且拼接了BirA底物肽序列(BSP)的融合蛋白重组表达载体pET-BF2-BSP，在大肠杆菌(Escherichia coli )中得到表达，并优化了诱导剂浓度、起始诱导菌体浓度及诱导时间等表达条件。SDS-PAGE分析结果表明所得融合目的蛋白约为40 kD，Western-blot结果显示该重组蛋白成功融合了6×His标签；pET-BF2-BSP最优化表达条件分别为：菌体起始诱导浓度OD600nm 0.8~1.2，IPTG诱导浓度1.1 mmol/L，诱导时间2~4 h；建立了该重组蛋白变性状态下通过镍柱亲和层析纯化包涵体的方法。实验获得了高纯度的在体外构建鸡MHC-肽四聚体所需的重组蛋白BF2-BSP。 相似文献
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利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。 相似文献
16.
α-乳清蛋白(α-lactalbumin,α-LA)是哺乳动物乳汁中一种重要的蛋白质,富含机体必需氨基酸和支链氨基酸,其极佳的氨基酸比例、易吸收性以及功能特异性,使得α-LA在婴幼儿个体正常生长中具有重要的意义。本实验旨在构建人α-乳清蛋白真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,将其转染至猪(Susscrofa)的成纤维细胞,获得稳定表达人α-LA的细胞。根据猪基因密码子偏爱性优化并合成人α-乳清蛋白基因mRNA序列opLA,并将其定向克隆入pIRES2-Zs Green1真核表达载体,双酶切及测序方法鉴定重组载体;脂质体介导的方法将载体转染入培养的猪成纤维细胞,荧光显微镜下观察转染效果,G418抗性筛选重组细胞;RT-PCR方法检测目的基因的表达。结果表明,通过酶切以及测序鉴定得到的重组载体pIRES2-Zs Green1-opLA构建成功;荧光显微镜下观察,转染了pIRES2-Zs Green1-opLA和pIRES2-Zs Green1空载体的细胞均发出绿色荧光,且荧光多集中于细胞核;筛选重组细胞的最小G418浓度为400ng/μL;RT-PCR法检测到与目的基因大小一致的片段,而未转染组和转染空载体组均未检测到。本实验成功构建真核表达载体pIRES2-ZsGreen1-opLA,并获得稳定表达目的基因的猪成纤维细胞,该细胞可作为进一步研究转基因克隆猪的供体细胞。 相似文献
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甲状腺激素应答基因（thyroidhormone responsive SPOT14,THRSP）是受甲状腺激素诱导表达的核内基因,参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控,对动物脂肪生成具有重要的调控作用。为进一步研究猪SPOT14基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验将猪SPOT14（GenBank登录号:JF951726）的ORF片段与表达载体pET-28α（+）进行重组,获得的重组子pET-28α（+）-S14,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL2l（DE3）感受态细胞,重组菌经IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析显示,目的蛋白分子量约为20.91kD,且主要以包涵体形式存在,最佳诱导条件是37℃1mmol/LIPTG诱导5h。将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后,采用Western blot进一步检测到了21kD目的蛋白的表达。重组质粒pET-28α（+）-S14在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地得到了表达,不仅为SPOT14基因生物学功能的研究,而且为进一步研究S14蛋白功能,了解脂肪代谢调控机制提供了基础资料。 相似文献