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以选育的获得产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌MD106为出发菌株,通过重叠延伸PCR及自杀载体介导的同源重组技术构建panBC及alaT双基因缺失的突变株MD106ΔpanBC/ΔalaT,并对出发菌及双缺失重组菌进行摇瓶发酵试验,测定发酵指数。结果显示,发酵40h后,突变株的L-亮氨酸的产量为7.91g/L,比出发菌株提高43.3%,而且主要杂酸——丙氨酸减少超过80%,总杂酸比例较出发菌株减少55.6%。 相似文献
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阿维链霉菌aveC基因缺失对产素调控的影响 总被引：1，自引：0，他引：1
通过构建仅含有aveC基因两端交换臂的缺失载体,与阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)染色体中aveC基因发生同源重组,以阻断该基因,从而获得aveC缺失突变株。并经摇瓶发酵和高效液相色谱检测不同阿维菌素组分产量。结果显示,aveC缺失突变株的阿维菌素的总产量与出发菌株的总产量差异不显著;而阿维菌素组分1的产量下降约58%,组分2的产量提高约52%。 相似文献
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[目的]分析益生菌EcN的荚膜多糖合成基因簇,寻找致病性大肠杆菌K5菌株的肝素前体多糖替代来源。[方法]通过基因敲除、基因回补、1H核磁共振(NMR)检测等技术手段,研究了kfiA基因在EcN荚膜多糖合成过程中的功能。[结果]利用λ-red重组系统成功构建了kfiA突变株,利用NMR检测发现kfiA缺失突变株的荚膜多糖特征峰消失,又通过染色体重组技术,把kfiA基因插入了EcN突变株的基因组中,核磁共振检测重新发现了荚膜多糖特征峰。[结论]kfiA基因是EcN菌株荚膜多糖合成途径的一个关键基因,参与了荚膜多糖合成。λ-red重组系统与染色体重组技术同样适用于EcN菌株,可为后续的菌株改造提供参考。 相似文献
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枯草芽孢杆菌GMP还原酶基因（guaC）突变株的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
以受体菌的guaC基因为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pGT9GH,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pGT9GH整合到受体菌的染色体上,构建了guaC基因的缺失突变株B.subtilis GJ07,并在guaC基因的5′端和3′端之间引入了一个拷贝核黄素操纵子,通过PCR方法验证了同源重组的正确性,最后测定了同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量。结果表明：同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量明显高于初始菌株GJ06,发酵60 h提高了24.5%。 相似文献
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枯草芽孢杆菌GMP还原酶基因（guaC）突变株的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
以受体菌的guaC基因为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pGT9GH,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pGT9GH整合到受体菌的染色体上,构建了guaC基因的缺失突变株B.subtilisGJ07,并在guaC基因的5′端和3′端之间引入了1个拷贝核黄素操纵子,通过PCR方法验证了同源重组的正确性,最后测定了同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量。结果表明：同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量明显高于初始菌株GJ06,发酵60h提高了24.5%。 相似文献
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利用基因敲除的方法将野生型谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)定向缺失dtsR1基因,构建△dtsR1突变菌株,分析其在无诱导条件、添加吐温-40及生物素限制条件下菌体的生长和谷氨酸生产情况,并与野生型谷氨酸棒状杆菌在相同的发酵条件下进行比较.结果发现,在无诱导条件下,△dtsR1突变菌株能够引发谷氨酸的合成,而野生型谷氨酸棒状杆菌不分泌谷氨酸.在添加吐温-40及生物素限制条件下,△dtsR1突变菌株的谷氨酸产量明显高于无诱导条件下的谷氨酸产量.dtsRl基因的缺失提高了菌株的生长与谷氨酸合成的能力,在无诱导条件下也能促使谷氨酸的合成. 相似文献
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赖氨酸的高产菌株已通过经典的诱变法获得,但要再提高这些诱变株的产量就很困难.赖氨酸的生物合成很有规律,它不仅依赖于赖氨酸合成途径中的酶,而且依赖于驱动合成赖氨酸的碳源代谢的酶.为了提高赖氨酸产率,就要求改变碳源的供应,从而控制中间物向赖氨酸合成的转化.二氨基庚二酸合酶基因(dapA)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)是菌体在赖氨酸合成代谢途径中,控制表达二氨基庚二酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的关键基因.我们首先分别克隆这两个基因,并使之处于一定启动子控制下.然后将dapA和ppc重组克隆到同一个载体,并转化赖氨酸发酵菌,从而提高菌体内的酶活,进一步提高赖氨酸发酵产率. 相似文献
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胶状溶杆菌OH17菌株遗传操作系统的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
《南京农业大学学报》2017,(4)
[目的]建立胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)OH17菌株的遗传操作系统,通过基因重组方法来研究调控基因的功能及次级代谢产物的生物合成途径。[方法]分别将整合型突变质粒p JQ-pilR和用于同源重组的、包含参与抗菌物质生物合成的DNA片段的质粒p SEVA321-pilR,通过电转化法各自导入L.gummosus OH17之中。[结果]通过电转化获得正确转化子,结合基因重组获得突变菌株,采用PCR验证和酶切验证重组质粒的导入和目标基因pilR的缺失,进一步对突变菌株的发酵产物进行了HPLC分析,结果表明突变株合成热稳定抗真菌因子(heat-stable antifungal factor,HSAF)能力明显下降,通过将pilR回补,其合成HSAF的能力得到一定程度恢复。[结论]成功构建了L.gummosus OH17遗传操作系统,包括基因定位缺失突变系统和基因功能互补系统,为以后对OH17及其他胶状溶杆菌进行代谢产物合成及其调控基因的功能研究奠定了遗传操作基础。 相似文献
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[目的]构建了负责运输苏氨酸至胞外的转运蛋白的关键基因rhtB过表达的苏氨酸发酵菌M122,考察不同的碳源、氮源及pH对该重组菌产L-苏氨酸的影响。[方法]选用不同的碳、氮源对L-苏氨酸生产菌株的发酵过程进行分析,对发酵培养基的碳、氮源及pH进行优化。[结果]定向改造后苏氨酸发酵菌对营养物质的利用效率增加,使用蔗糖作为碳源发酵时,摇床培养L-苏氨酸产量为28.1 g/L;以（NH4）2SO4或酵母粉作为氮源发酵时,L-苏氨酸产量分别为27.8和28.2 g/L,均优于使用其他氮源时苏氨酸的产量。对发酵的最适pH研究表明,中性条件下更有利于菌体的生长和L-苏氨酸的产生。[结论]确定了苏氨酸发酵菌M122的最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为（NH4）2SO4或酵母粉,最适pH为7.0。 相似文献
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大肠杆菌(Escherichia coli)K12基因组中,仅dctA基因编码1个在有氧条件下负责摄取四碳-二羧酸的转运蛋白。为鉴定Dct A能否摄取四碳-2-羟基羧酸(如苹果酸),首先以p KD3为模版PCR扩增含有氯霉素抗性dctA基因同源臂,电转入E.coli K12/p KD46感受态细胞,筛选具有氯霉素抗性的基因敲除突变株E.coliΔdctA/p KD46。通过消除质粒p KD46构建大肠杆菌dctA基因敲除突变株E.coliΔdctA。构建dctA基因表达载体p Easy T3-dctA。通过苹果酸摄取功能互补试验,证实基因敲除菌株E.coliΔdctA丧失摄取苹果酸功能,四碳-二羧酸摄取蛋白Dct A具有摄取苹果酸功能。研究首次报道Dct A具有摄取苹果酸功能,该基因敲除突变株的构建可为其他菌株来源2-HCT转运蛋白的基因克隆与功能分析奠定基础。 相似文献
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按不完全双列杂交设计(NCⅡ杂交设计)组配了44个杂交组合,对4个非-Reid(非瑞德)群自交系的一般配合力和特殊配合力进行分析.结果表明:增加产量配合力高的组合有‘LX9801×9858’、‘LX9801×8112’、‘LX9801×9058’、‘LX9801×9537’、‘昌7-2×沈137’、‘昌7-2×5276’、‘昌7-2×9537’、‘7117×5003’、‘7117×9858’、‘7117×郑58’、‘7117×9558’、‘K12×沈137’、‘K12×478’、‘K12×8112’、‘K12×K22’;增加百粒质量配合力高的组合有‘LX9801×K22’、‘LX9801×9537’、‘昌7-2×K22’、‘昌7-2×5276’、‘7117×郑58’、‘7117×9558’、‘K12×沈137’、‘K12×478’、‘K12×9058’、‘K12×8112’、‘K12×5003’;降低株高配合力高的组合有‘7117×5276’、‘昌7-2×9558’、‘7117×9537’、‘7117×K22’、‘7117×478’、‘昌7-2×郑58’;降低穗位高配合力高的组合有‘昌7-2×郑58’、‘7117×K22’、‘7117×9537’、‘昌7-2×5003’、‘7117×8112’、‘昌7-2×9058’;在4个非-Reid父本系中,产量配合力由高到低依次为‘LX9801’>‘昌7-2’>‘K12’=‘7117’;‘7117’一般配合力低于‘昌7-2’,可使F1代行粒数增加,并有降低株高和穗位的致矮遗传效应;对受加性基因控制的穗长、结实长、穗粗、穗行数、行粒数、株高、百粒质量等性状,宜进行早代选择;穗位、叶面积系数和小区产量等性状受非加性基因作用相对较大,宜进行晚代选择;应扩大供体遗传范围对‘昌7-2’受体进行遗传改良. 相似文献
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分析甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)围食膜几丁质结合蛋白SeCBP66氨基酸序列,利用PCR技术扩增获得缺失信号肽编码区围食膜几丁质结合蛋白的基因△(s)-secbp66。将△(s)-secbp66克隆到表达载体pET28a和pPIC9K,分别转化大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115进行原核及真核表达;将△(s)-secbp66克隆到质粒pFastBacTM,转化大肠杆菌DH10Bac构建重组Bacmid,转染昆虫细胞系Sf9及BTI-TN-5B1-4(HighFive)从而在昆虫细胞系中进行表达。结果表明:SeCBP66在原核细胞中未见表达,在酵母细胞中表达产物呈弥散状,而在昆虫细胞系中则能稳定的表达116kDa的特异蛋白。 相似文献
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OmpT(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-OmpT。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的OmpT蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。 相似文献
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为了明确肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli)O157∶H7大质粒pO157编码的蛋白质ToxB与O157∶H7在肠道黏附、定殖的关系,构建含有toxB基因同源臂的重组自杀性质粒pMEG375-BN-Kan-BC,转化SM10宿主菌获得重组SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)。将SM10(pMEG375-BN-Kan-BC)与O157∶H7进行混合培养,通过同源重组,获得杂交toxB基因缺失株。用体外接种的HEp-2细胞和体内感染链霉素处理的小鼠,明确缺失株黏附定殖能力。经PCR和Western blot鉴定,toxB基因被卡那霉素(Kan+)选择标记基因表达盒所代替。O157∶H7(△toxB)生长特性与亲本株相比无明显差异。O157∶H7(△toxB)与亲本株相比,对HEp-2细胞的黏附能力降低了2倍。口服感染小鼠后,O157∶H7(△toxB)第3 d粪便排菌量仅为3.1×105 CFU,持续排菌11 d;而亲本株排菌量高达4.03×107 CFU,持续排菌时间超过14 d。 相似文献
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【目的】由于草甘膦在农业生产中的广泛使用,抗草甘膦转基因作物的研究一直是转基因作物研究的热点,其中草甘膦抗性功能新基因的挖掘是核心问题。自然界中微生物种类繁多,基因资源丰富,论文拟从广东地区农田土壤中筛选和鉴定出高抗草甘膦菌株,克隆其草甘膦靶标酶基因并进行抗性水平验证,以期获得高抗草甘膦新基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。【方法】用含有浓度梯度草甘膦的选择培养基从备选土壤中筛选出具有高抗草甘膦特性的菌株;通过显微观察、革兰氏染色以及16S rDNA序列分析结果对菌株种类进行鉴定;利用RT-PCR技术克隆该菌株的草甘膦靶标酶基因aroAS001,并通过序列比对和系统发育树分析aroAS001序列的基本特征;利用重叠 PCR法对aroAS001变异位点进行定点突变获得aroAS001-mut序列后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段转入aroA基因缺陷型菌株DH5α/△aroA中进行基因功能互补和草甘膦抗性水平验证。【结果】分离出一株高抗草甘膦菌株,经形态学和分子生物学鉴定该菌株为肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）,命名为kpS001;克隆该菌株草甘膦靶标酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）基因aroAS001,序列分析结果显示由该基因所编码的氨基酸序列具有典型的Class I EPSPS特征,但与已报道肺炎克雷伯氏菌的aroA相比其第227位碱基发生突变,致使对应的氨基酸发生变异。对该基因差异位点进行核酸定点突变获得aroAS001-mut基因片段后,将aroAS001和aroAS001-mut基因片段分别转入缺陷型大肠杆菌菌株DH5α/△aroA进行功能互补验证,与对照菌株相比,转入aroAS001和aroAS001-mut的重组菌株均能在含200 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中能够正常生长,表现出良好的抗性,之后随着草甘膦浓度增加其生长状态开始受到抑制,当草甘膦浓度达到350 mmol?L-1时,菌株生长基本完全被抑制。【结论】肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株是一株高抗草甘膦菌株,由aroAS001编码的草甘膦靶标酶EPSPS属于Class I EPSP合成酶,aroAS001对草甘膦具有优良抗性,能在含350 mmol?L-1以下浓度草甘膦的培养基中生长,该基因可以作为备选基因资源用于抗草甘膦转基因作物的研究。 相似文献
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大肠杆菌K88菌毛蛋白faeG亚基基因克隆及表达 总被引：3，自引：0，他引：3
利用PCR技术,从致仔猪黄痢的大肠杆菌中扩增不含信号肽序列的K88菌毛蛋白faeG亚基基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,构建该基因的原核表达载体pGEX-FaeG,通过测序证明序列正确后,导入大肠杆菌BL21,得到工程菌株PGEX-FaeG。IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白（约53ku）在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达产物约占菌体蛋白的35％,免疫印记结果表明此融合蛋白与K88单抗反应。 相似文献
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采集新疆奶牛隐性乳腺炎乳样,经分离、鉴定,从中得到乳源大肠杆菌,并将大肠杆菌菌株用大肠杆菌O因子血清标定。根据GenBank已发表的Irp2基因序列,用Oligo 6.0生物软件设计一对特异性引物。对分离得到的大肠杆菌菌株提取基因组DNA,利用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。结果表明,所分离大肠杆菌中Irp2基因阳性率为35.3%(12/34),阳性样品的测序结果与已发表的Irp2基因序列高度同源,同源率在98%以上。同时发现Irp2基因的阳性率与血清型并没有相关性。 相似文献