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1.
《中国兽医学报》2016,(3)
根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列设计2对特异性引物,第1对通用引物扩增美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因(466bp/376bp),第2对引物特异性扩增欧洲型毒株ORF7基因(580bp)。反应条件优化后,建立了能够同时检测美洲型经典毒株、美洲型变异毒株和欧洲型毒株的多重PCR检测方法。该方法可以特异性扩增3种毒株的基因,目的基因片段大小差异在90bp以上便于电泳观察,重组质粒标准品检测下限为1.93×103拷贝。应用该方法检测183份临床疑似病例,结果 PRRSV阳性35份,其中美洲型经典株2份,美洲型变异株31份,欧洲型毒株3份,美洲型变异株和欧洲型毒株混合感染1份。表明建立的多重PCR检测方法具有快速、准确、敏感等优点,对PRRSV 3种毒株的快速诊断有十分重要的意义。 相似文献
2.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV基因序列设计3对特异性引物,即第1对通用引物扩增美洲型和欧洲型病毒株ORF7基因(433 bp/398 bp)、第2对引物扩增美洲型经典病毒株和高致病性变异株(HP-PRRSV)Nsp2基因(338 bp/248 bp)、第3对引物扩增欧洲型病毒株ORF5基因(614 bp)。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分美洲型经典病毒株、HP-PRRSV株以及欧洲型病毒株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异扩增3种病毒的基因,其重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝;而与猪的其它重要病原均无交叉反应。应用该方法检测176份临床疑似病料样品,结果 PRRSV阳性45份,其中美洲型变异病毒株41份、经典病毒株4份,未检测到欧洲型病毒株。表明本研究建立的多重RT-PCR检测方法可以用于PRRSV的快速鉴别诊断和流行病学调查。 相似文献
3.
为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测. 相似文献
4.
为了建立鉴别猪瘟病毒(Classical swine virus,CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)及经典猪繁殖与呼吸综合征病毒(C-PRRSV)的快速检测方法,根据GenBank中公布的已知序列,设计合成了针对CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV特异性引物。经过引物筛选及对退火温度、引物比例等扩增条件的优化,建立了用2对引物同时检测CSFV、HP-PRRSV和C-PRRSV的多重RT-PCR方法。该方法可同时扩增出287bp的CSFV、374bp的HP-PRRSV和464bp的C-PRRSV目的核苷酸片段,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等无交叉反应,最低可以检测到11.3pg的CSFV、4.7pg的HP-PRRSV和2.8pg的C-PRRSV总RNA。分别用多重和单项RT-PCR检测了从河北省采集的31份血清或组织样品,其中CSFV、HP-PRRSV、C-PRRSV以及CSFV与HP-PRRSV混合感染的检出率分别为19.4%、22.6%、0%与9.7%,多重与单项RT-PCR的符合率为100%。本试验建立的多重RT-PCR方法可同时鉴别CSFV、HP-PRRSV与C-PRRSV,适于猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速检测与流行病学调查。 相似文献
5.
根据猪瘟病毒(CSFV)以及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列特点,设计3对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV以及美洲型、欧洲型PRRSV的多重TaqMan荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法。该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪的其它常见病毒无交叉反应;对CSFV及美洲型、欧洲型PRRSV3种重组质粒标准品的检出下限均为2.68拷贝/μL;组内及组间重复试验的变异系数均小于1.5%。应用该方法对253份临床疑似样品进行检测,结果病原阳性106份,其中20份为CSFV阳性,86份为美洲型PRRSV阳性,11份为CSFV和美洲型PRRSV混合感染,未检测到欧洲型PRRSV。试验表明,研究建立的多重qRT-PCR方法可用于CSFV和PRRSV的快速鉴别检测及流行病学调查。 相似文献
6.
《畜牧与兽医》2017,(2):83-88
为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株及弱毒疫苗株快速鉴别检测方法,根据Gen Bank中公布的PEDV野毒株及弱毒疫苗株的ORF3基因序列,在缺失区的两端设计合成1对特异性扩增引物,用以特异性的扩增PEDV ORF3基因片段,根据目的片段大小判断PEDV的毒株类型;通过退火温度等反应条件优化,建立了区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR鉴别检测方法。结果显示:所建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分PEDV野毒株和弱毒疫苗株;PEDV野毒株扩增出234 bp目的片段,PEDV弱毒疫苗株扩增出185 bp目的片段;与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、A群猪轮状病毒(PRo VA)、猪嵴病毒(PKV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)及猪细小病毒(PPV)均无交叉反应;敏感性试验显示,该方法能检测到病毒滴度为1.3×10~3TCID_(50)/mL。利用该方法对采集自广西部分地区93份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV野毒株阳性率为61.29%(57/93),弱毒株阳性率为5.38%(5/93)。结果表明:该RT-PCR鉴别检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,能快速、准确地区分PEDV自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株,为猪流行性腹泻的快速诊断及病原分子鉴别检测研究提供了可供借鉴的技术手段。 相似文献
7.
《中国预防兽医学报》2010,(9)
为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIVM基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法。检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345bp)和PRRSV(520bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV2种病毒混合液的最小检出量分别为102EID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒。证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测。 相似文献
8.
SIV与PRRSV、CSFV、PCV-2和PRV交叉感染的检测 总被引：2，自引：0，他引：2
采用RT-PCR方法对37份疑似猪流感病毒(SIV)感染病料进行了病原学检测。同时,还运用PCR和RT-PCR方法对SIV阳性病料进行了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)目的基因片段的扩增。结果,扩增出了SIV特异目的基因片段,且4份病料都为混合感染,感染状况分别为SIV/PRRSV/PRV,SIV/CSFV/PRRSV三重感染,SIV/PCV-2和SIV/PRRSV二重感染。 相似文献
9.
为了建立一种快速鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的病原学方法和掌握洛阳市PEDV变异毒株的流行规律,试验根据GenBank中PEDV变异毒株的特异性序列设计引物,通过优化退火温度、模板添加量、引物添加量建立PEDV变异毒株一步法RT-PCR鉴别检测方法,并分析了该方法的特异性、敏感性和重复性;同时应用该方法检测采集自洛阳市的251份临床样品,并对不同地区、不同年份、不同养殖模式的检测结果进行比较分析。结果表明：优化后的退火温度为51℃,模板添加量为5μL,引物添加量为0.5μL;该方法对PEDV变异毒株能够扩增出550 bp特异性条带,而检测的PEDV经典毒株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均为阴性;对PEDV变异毒株RNA的最低检测限达到0.74 ng,对3份PEDV变异毒株阳性病料和3份PEDV变异毒株阴性病料重复检测3次的结果完全一致;检测采集于洛阳市251份临床样品的平均阳性率为29.48%,其中不同地区阳性率... 相似文献
10.
根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。 相似文献
11.
为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×103拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。 相似文献
12.
To establish a rapid method for differential detection of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), a multiple RT-PCR assay was established. In this assay, two pairs of primers were designed according to the genomic sequences of classical, highly pathogenic and TJM-F92 vaccine strains of PRRSV. The assay could only detect PRRSV, but not detect CSFV, FMDV, PRV and PCV2. The detection limit of the method was as little as 1.13×103 copies/μL of templates. The established assay was successfully used to detect 349 clinical samples and 119 samples were positive for PRRSV, of which 5 samples were positive for classical PRRSV (C-PRRSV), 107 samples for highly pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) and 7 samples for TJM-F92 vaccine strain (V-PRRSV), while 7 samples were positive for HP-PRRSV and V-PRRSV. The results indicated that the established multiple RT-PCR assay could be used for differential detection and epidemiological investigation of PRRSV. 相似文献
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猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用 总被引：9，自引：0，他引：9
猪瘟病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪伪狂犬病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。本研究通过设计4对针对这4种病毒的特异引物建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:其敏感性可达到CSFV 10 TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50 CSFV 10TCID50,PPV 10TCID50,PRRSV 1 TCID50,PRV 100 TCID50。同时具有较好的特异性,对猪瘟病毒石门株、猪瘟病毒兔化弱毒株、PRV闽南A株、PPV弱毒疫苗株、PRRSV KY 35株及PRRSV B13株6个毒株均能扩增出相应的片段,而BVDV、BDV均未扩增出相应的片段。本方法的建立对于这4种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。 相似文献
14.
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5种猪病多重PCR检测方法的建立 总被引：1，自引：0，他引：1
To establish a method for simultaneous detection of classical swine fever virus (CSFV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), pseudorabies virus (PRV), porcine circovirus type 2 (PCV2) and porcine parvovirus (PPV), a multiplex PCR was developed with a set of specific primers designed based on the conserved sequences of CSFV, PRRSV, PRV, PCV2 and PPV. Under the optimized conditions of multiplex PCR,five special fragments of 167 (CSFV),433 (PRRSV),305 (PRV), 559 (PCV2) and 882 bp (PPV) were amplified with a detection limit of 220, 1.6, 72, 400 and 370 pg, respectively. But the multiplex PCR amplification results of swine influenza virus （SIV）, Japanese encephalitis virus （JEV）, Streptococcus suis （SS） and porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） were negative．The results showed that the multiplex PCR method was capable of CSFV, PRV, PRRSV, PCV2, PPV infection of single or mixed clinical samples for rapid diagnosis. 相似文献
16.
通过对GenBank已公布猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）普通株与变异株Nsp2基因序列进行比对分析,设计合成3条引物,建立一步鉴别诊断普通株与变异株PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明,PCR扩增获得的普通株片段大小为267bp,变异株片段大小为180bp。敏感性试验结果表明该方法具有较高的敏感性,能检测到含量为1.5pg的核酸含量;特异性结果表明该方法在同等条件下检测PRV、CSFV、PCV-2、JEV、CPV、TGEV、SIV均为阴性。对2009-2010年送检的100份临床样品进行检测,结果检出26份变异PRRSV,8份普通PRRSV,阳性率为34%;与ELISA抗体检测试剂盒比较,多检出4份阳性样品。表明建立的鉴别诊断PRRSV的RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,适用于临床针对PRRSV的检测。 相似文献
17.
根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用 总被引：1，自引：0，他引：1
本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。 相似文献
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猪瘟病毒野毒株与疫苗株酶切检测方法的建立、优化及应用 总被引：2，自引：0，他引：2
为有效鉴别猪瘟病毒强毒株(Shimen)与弱毒疫苗株(HCLV),根据GenBank上已发表的猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因高度保守区设计一对特异性引物,在其跨越区内部有Shimen株独有的限制性内切酶Bgl Ⅱ酶切位点,采取酶切RT-PCR产物的方法鉴别Shimen株和疫苗株,同时对该方法的特异性和敏感性进行检测。结果表明,应用该方法从Shimen株和疫苗株中均能扩增出一条大小为750 bp的特异性片段,疫苗株的RT-PCR产物不能被Bgl Ⅱ酶切,Shimen株的RT-PCR产物则被酶切为大小分别为520和230 bp的两条带。此方法可扩增猪瘟病毒的E2基因保守片段,对病毒RNA的最小检出量为3.96×10-4 μg/mL。采用此方法检查了30例临床疑似猪瘟病料,结果3例感染猪瘟病毒强毒,21例为猪瘟弱毒疫苗株,其他为猪瘟阴性。 相似文献