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鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达及多克隆抗体的制备 总被引：5，自引：0，他引：5
将克隆得到的鸡 IFN- γ基因亚克隆到大肠杆菌原核表达载体 p PROEXTMHT的 Pst 和 Kpn 位点上 ,构建了重组表达质粒 p PROEXTMHT- IFN -γ,经序列分析鉴定 ,确证目的基因克隆入载体的预期位点。将重组质粒转化大肠杆菌 DH5 α,于 37℃不同时间诱导培养 ,SDS- PAGE电泳表明 ,该基因在大肠杆菌中发生高水平表达 ,表达的鸡 IFN- γ融合蛋白相对分子质量约为 2 2 0 0 0。重组蛋白占菌体总蛋白的 33%。经 Western blot鉴定 ,该重组蛋白质具有生物学活性。包涵体被 6 mol/ L 盐酸胍裂解后 ,通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡 IFN- γ融合蛋白及其纯化产物经 3次肌肉注射于新西兰白兔 ,制备了兔抗鸡 IFN- γ多克隆抗体。琼脂扩散结果表明 ,多克隆抗体可与纯化的鸡IFN -γ重组蛋白发生特异性反应 相似文献
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猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备 总被引：3，自引：3，他引：0
从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础. 相似文献
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为了探究白羽鹌鹑IFN-γ的相关特性,本试验利用从刀豆素A诱导培养的鹌鹑外周血淋巴细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增IFN-γ基因片段并构建pEASY-Blunt-coIFN-γ克隆载体,测序表明,白羽鹌鹑IFN-γ(coIFN-γ)开放阅读框大小为495 bp,包含1个由24个氨基酸组成的信号肽序列和140个氨基酸组成的成熟肽序列,有2个糖基化位点。进化树结果显示,coIFN-γ基因与日本鹌鹑同源性最高,达到100%,与鸡形目动物差异不明显,同源性能达到95.6%。构建重组表达载体pET-32a(+)-coIFN-γ,并在大肠杆菌系统中诱导表达。丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,coIFN-γ重组蛋白大小约为40.0 kDa,均存在于包涵体中。通过本试验得到了coIFN-γ基因,原核表达coIFN-γ分子蛋白,并对其理化性质做了初步研究,为鹌鹑养殖业抗病毒生物制剂的研发提供理论基础。 相似文献
4.
猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 总被引：8，自引：1，他引：8
提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 IFN-γ具有较高干扰素活性 相似文献
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试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。 相似文献
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为了使干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23 ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244 ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。 相似文献
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为对犬孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒进行免疫学评价,本实验以含有MAG1-IFN-γ基因片段的克隆质粒为模板,扩增MAG1-IFN-γ目的片段,构建pVAX-MAG1-IFN-γ重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达,并免疫BALB/c小鼠,进行免疫学评价。结果表明,PCR扩增获得基因片段大小为1 536 bp,与GenBank中登录的MAG1和IFN-γ核苷酸序列的同源性为99%;IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,转染的Vero细胞呈现特异性绿色荧光;western blot分析表达蛋白的分子量为57 ku,具有较好的反应原性。将构建的重组真核表达质粒免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和T淋巴细胞亚群含量测定表明,重组质粒具有较好的免疫原性。本实验为新孢子虫病核酸疫苗的深入研究奠定了基础。 相似文献
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根据发表的犬新孢子虫MAG1基因序列(EF580924.1)和Bov IFN-γ基因序列(M29867.1)设计2对引物.分别以犬新孢子虫基因组DNA和pET28α-IFN-γ重组质粒为模板,通过重叠延伸拼接聚合酶链式反应(SOE-PCR)将犬新孢子虫MAG1基因与IFN-γ基因拼接,构建pMD18-T MAG1-IFN γ克隆质粒和pGEX-4T-MAG1-IFN-γ重组表达质粒,将鉴定正确的pGEX-4T-MAG1-IFN-γ重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blotting分析表达产物.结果表明,SOE PCR扩增获得双基因融合片段大小为1 491 bp,与GenBank中发表的MAG1 (EF580924.1)和IFN-γ(M29867.1)核苷酸序列的同源性为99％；MAG1-IFN-γ融合基因表达蛋白大小为82 000,具有较好的反应原性. 相似文献
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本研究对破伤风毒素C片段进行了基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。应用PCR技术直接从破伤风梭菌64008菌株基因组中扩增出大小为1356 bp的破伤风毒素C片段(TetC)基因,经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank上登录的序列AF154828的同源性达到99.2%。将此基因克隆至大肠杆菌融合表达载体pGEX-6P-1,构建成重组表达质粒pGEX-6P-1-TetC,并在大肠杆菌BL21中表达,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的21%。经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定,表达产物为76 Ku左右的重组蛋白,经免疫印迹试验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。 相似文献
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为克隆和表达编码隐孢子虫鼠基因型卵囊壁蛋白CP41基因,以隐孢子虫鼠基因型卵囊总RNA作为模板,RT-PCR扩增CP41基因,克隆到pMD18-T载体并进行序列测定,构建重组质粒pGEX-5x-3-CP41,转化BL21(DE3)感受态细胞进行诱导,表达产物SDS-PAGE检测目的蛋白,westernblot分析该重组蛋白的免疫活性。结果显示,克隆的目的基因核苷酸序列与GenBank登录中的序列比较,同源性为90.5%,氨基酸序列同源性为87.57%。重组质粒转化菌在IPTG诱导下以包涵体形式高效表达,表达的融合蛋白大小约为46ku,westernblot分析显示,纯化复性后的重组蛋白可被辣根过氧化物酶标记的抗谷胱甘肽巯基转移酶(GST)单克隆抗体、隐孢子虫兔基因型感染兔血清特异性识别。ELISA检测结果表明,该蛋白3次免疫无特征病原体新西兰白兔后,兔血清特异性抗体达到较高水平,表明表达的重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。 相似文献
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参照Digby 发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列,设计1对引物,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从Con A诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性的扩增出大小约为 500 bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序,结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100%。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-γ,并将其导入大肠杆菌BL21中,诱导表达的重组蛋白经 SDS-PAGE 分析分子质量约为 43 ku,表明所克隆的CHIFN-γ 基因在原核细胞中得到表达。 相似文献
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根据GenBank发表的牛白细胞介素2(BoIL-2)基因序列,设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增出重组牛白细胞介素2(rBoIL-2)基因。将克隆片段与pMD18-T载体连接,并经过酶切及PCR鉴定,测序结果显示,克隆的BoIL-2基因与GenBank发表的BoIL-2基因序列同源性为98.7%。将测序正确的克隆片段与pET30a(+)载体连接,构建重组表达质粒pET30a(+)-rBoIL-2,通过双酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒进行序列测定后在大肠杆菌的表达,分子质量约为23.49 ku;表达产物主要分布在包涵体中。Western blotting证实所得到的重组蛋白为BoIL-2重组蛋白。用镍离子亲和树脂对所得的BoIL-2重组蛋白进行纯化,并免疫新西兰兔成功制备兔抗rBoIL-2多克隆抗体,为下阶段的研究提供了重要的试验材料。 相似文献
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为了研究鹅α干扰素(goIFN-α)基因原核表达产物的反应原性并进行goIFN-α抗血清的制备,试验首先根据大肠杆菌偏爱密码子对goIFN-α基因进行优化,随后采用PCR方法扩增goIFN-α编码序列并进行同源性分析。将goIFN-α片段与表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE和Western-blot检测。通过切胶回收的方法回收目的条带,将碾碎的蛋白胶与PBS混合后注入小鼠体内,15 d后回收血清进行Western-blot检测。结果表明:试验成功扩增出goIFN-α基因;与多种IFN-α基因序列进行比较,goIFN-α基因氨基酸序列的同源性为92.5%～98.1%;随后成功构建出重组表达质粒pET-28a-goIFN-α,并将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,重组蛋白goIFN-α的分子质量约为18 ku,具有良好的反应原性;回收血清进行Western-blot检测,鼠抗goIFN-α血清制备成功。说明重组goIFN-α蛋白能够在大肠杆菌中表达,大小符合预期且具有良好的反应原性,并成功制备出鼠抗goIFN-α血清。 相似文献
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为合成与天然构象相似的干扰素γ蛋白,通过优化干扰素序列的密码子序列,利用杆状病毒表达系统合成真核重组牛IFN-γ蛋白。实验化学合成牛IFN-γ基因,并将该基因克隆至真核表达载体pFastBacHTA中,将构建成功的重组载体与DH10Bac感受态大肠杆菌进行转座形成穿梭载体,穿梭载体质粒瞬时转染至SF9昆虫细胞中,获得重组杆状病毒,最后利用SF9昆虫细胞悬浮培养大量表达目的蛋白。蛋白纯化后经Western Blotting和BOVIGAM牛分枝杆菌IFN-γELISA检测试剂盒检测分析,具有较好的免疫原性和反应原性。研究结果为牛IFN-γ的单克隆抗体制备以及牛结核病临床诊断奠定了基础。 相似文献
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参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
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参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT-PCR．技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-1，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。 相似文献
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利用RT-PCR技术,从ConA活化的猪外周血淋巴细胞中扩增出γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ) cDNA,克隆到pMD18-T载体中进行测序后,与原核表达载体pET32a(+)重组,表达含His×6的IFN-γ重组蛋白;测序结果与GenBank中已发表的序列进行比对,核苷酸同源性在98.6%~100.0%之间,氨基酸同源性在96.4%~99.4%;经SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,该重组蛋白分子质量约为27 ku,主要存在于包涵体中,且具有良好的免疫学活性,为进行γ-干扰素深入的研究奠定了基础。 相似文献