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1.
克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因,并进行序列分析及原核表达。根据GenBank公布的PRRSV ORF5基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV陕西分离株糖基化囊膜蛋白基因ORF5,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。再设计另外1对引物扩增ORF5缺失编码N端31个氨基酸残基的基因片段,将截短的ORF5基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行原核表达。结果扩增到603 bp的PRRSV全长ORF5基因,序列分析表明,分离株与北美型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%。因此推测陕西分离株属于北美型。SDS-PAGE可检测到大小约为38 ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。West-ern-blot分析表明,重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别。 相似文献
2.
PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。 相似文献
3.
根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)VR2332 株的核酸序列设计并合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增PRRSV NJ-a株ORF6基因,将其连接入pMD18-T载体,经测序后克隆入原核表达载体pET-32a( )上,构建原核表达载体pET-ORF6.阳性质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经异醛-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,PRRSV ORF6基因获得表达.以纯化的重组蛋白为抗原免疫家兔3次,获得抗PRRSV NJ-a株M蛋白的特异抗体.经Western-blotting证明,该多克隆抗体既能与原核表达的重组M蛋白发生反应,又能与PRRSV发生特异性反应;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与表达PRRSV M蛋白的293T细胞及感染PRRSV的Marc-145细胞发生反应.兔抗PRRSV NJ-a株M蛋白特异性抗体的获得,为进一步研究PRRSV M蛋白的表达和功能奠定了基础. 相似文献
4.
[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础. 相似文献
5.
猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因的克隆与表达 总被引：3，自引：2，他引：1
用RT-PCR方法从河南分离的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)变异株(HN07-1)中扩增ORF5全长基因,将其克隆至pMD19-T载体。测序结果表明,该序列与标准美洲株VR-2332同源性为89%,与我国早期分离的BJ-4株同源性为88%,与HB-1、JXAI变异株同源性为96%和99%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-Blot结果表明,成功表达了41.5 kD的融合蛋白。 相似文献
6.
根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的NSP2,ORF5-7基因的核苷酸序列,设计合成5对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出10株PRRSV河南地方株的NSP2和ORF5-7片段,将扩增片段克隆到pMD-18T载体并进行测序。应用DNAStar序列分析软件对分离株的NSP2和ORF5-7基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的PRRS毒株进行了同源性比较,结果表明PRRSV河南分离株的NSP2和ORF5-7基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%-98.1%和81.4%-96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.7%-61.7%和44.7%-45.9%;同时将PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因的推导氨基酸序列与其他美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了PRRSV河南分离株NSP2和ORF5-7基因发生了变异。 相似文献
7.
为了给河北地区预防和控制猪繁殖与呼吸综合征提供理论数据。应用RT-PCR方法特异性扩增HB-3(cz)株的ORF7(N)基因片段,将扩增片段克隆入pMD-T载体后测序,应用DNAstar分析软件对序列进行分析,并与GenBank中发表的PRRSV毒株序列进行比较。结果显示:HB-3(cz)株与高热病毒株JXA1、HUB2等及传统河北分离株HB-1(sh)氨基酸同源性高达97.6%,属美洲型毒株。将目的片段克隆入原核表达载体pGEX-6P-1,重组质粒pGEX-N转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达,经Western-blot-ting分析表明:表达的融合蛋白分子量约为39.5 kDa,能与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,为PRRSV血清学诊断方法的建立奠定了基础。 相似文献
8.
[目的]克隆PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体。[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5。以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定。[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定,结果与预期一致,证实重组质粒构建成功。[结论]成功构建了PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础。 相似文献
9.
PRRSV S-1株经Marc-145复苏后,通过RT-PCR扩增了ORF5和ORF7基因.利用酶切位点将2个基因分别连接到原核表达载体PET-32C中,筛选阳性克隆送测序,序列分析表明:PRRSV S-1株ORF5基因变异性较高,与VR-2332毒株和CH-1a毒株的同源性分别是:核苷酸同源性为91%和89%,氨基酸同源性是87%和85%;ORF7基因相对保守,核苷酸的同源性分别是97%和94%,氨基酸的同源性分别是95%和93%. 相似文献
10.
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR方法扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒临床分离株(HBKM2)的ORF5全基因,并进行了测序分析,根据0RF5的结构特点,进一步扩增了截去N端信号肽序列的ORF5(nsORF5),并将其克隆到pGEX-KG原核表达载体,构建了重组质粒pKG-ns5,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的nsORF5基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-nsGP5分子量约为43kD,并具有反应活性,这为进一步研究PRRSV GP5蛋白的功能及新型疫苗、血清学诊断方法的研制奠定了基础. 相似文献
11.
以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。 相似文献
12.
根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献
13.
根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3基因序列,设计合成了1对特异性引物,扩增出病毒ORF3结构基因。将该基因克隆到pMD18-T,构建了重组质粒pMD18-ORF3,并对筛选出的阳性质粒进行测序。应用序列分析软件对测序结果分析可知,克隆得到的ORF3基因组全长812 bp。通过DNAman对所测ORF3基因核苷酸序列与GenBank中登录的国内外PRRSV毒株核苷酸序列进行同源性比较。序列分析结果显示,XJPRRSV1/03与参考毒株VR2332、LV、CH-1a的核苷酸同源性分别为95.8%,89.8%,92.7%,氨基酸同源性分别为96.6%,88.5%,93.2%。XJPRRSV1/03与VR2332同源性最高。 相似文献
14.
构建表达猪PRRSV GP3蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。将去信号肽序列的PRRSV ORF3基因插入到表达载体pYA3341(Asd+)中,构建重组质粒pYA3341-ORF3。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(Asd-、Cya-、Crp-),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF3)。体外鉴定重组菌表达的GP3蛋白、重组菌特性并进行小鼠免疫试验。酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳及Western blot检测有GP3特异性蛋白条带,小鼠免疫后可检测到GP3蛋白抗体。成功构建能稳定表达PRRSV GP3蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒兰州分离株ORF3基因的克隆及杆状病毒载体的构建 总被引：1，自引：1，他引：0
根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch-1a,AY032626)设计包含完整ORF3序列的1对引物,采用RT-PCR方法扩增PRRSV甘肃Lanzhou株的ORF3基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHTA上,经酶切鉴定、PCR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacHTA-ORF3,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pFastBacHTA-ORF3转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid-ORF3.成功构建了PRRSV Lanzhou株ORF3基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础. 相似文献