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1.
orf61是杆状病毒晚期表达的核心基因之一。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重组技术与Bac-to-Bac系统分别敲除和异位补回orf61基因,构建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及补回型病毒orf61-reBacmid,然后分别转染家蚕培养细胞Bm N,调查orf61基因缺失对Bm NPV复制和不同时期基因转录的影响。检测orf61基因缺失型病毒转染Bm N细胞液上清中的病毒滴度为0,说明orf61基因缺失导致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);荧光定量PCR分析orf61基因缺失会显著地降低病毒基因组的复制水平,进而导致病毒各个时期基因转录水平极显著下降(P0.01)。此外,通过体外EMSA试验和构建双荧光素酶报告基因系统,检测ORF61蛋白对多角体蛋白基因polh启动子的调控作用,结果显示该蛋白质是polh基因转录的负调节因子。研究结果有助于深入阐释Bm NPV orf61基因在病毒基因组复制中的作用以及对极晚期表达的多角体蛋白基因polh的转录调控作用。 相似文献
2.
《蚕业科学》2015,(5)
在昆虫杆状病毒基因组中普遍存在一类凋亡抑制基因iap(inhibitor of apotosis)。核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的iap1和iap2基因为研究对象,分别构建BmNPV iap1、BmNPV iap2缺失型和补回型病毒,探究2个iap基因的生物学功能。病毒基因组DNA对BmN细胞的转染实验结果表明,BmNPV iap1基因缺失对病毒感染引起的细胞凋亡无显著影响,对病毒基因组的复制和基因转录也无明显影响;但BmNPV iap2基因的缺失可显著提高细胞的凋亡水平(P0.05),当利用iap2缺失型病毒基因组DNA转染BmN细胞时,胞内凋亡启动蛋白Caspase-3的活性与野生型病毒转染组相比显著上升,并且病毒滴度降为0。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析结果表明,BmNPV iap2的缺失大大降低了病毒DNA的复制水平和基因转录水平。基于上述试验结果可知:BmNPV iap2具有抑制由病毒感染诱导的细胞凋亡的作用,并且是病毒增殖的必需基因;而BmNPV iap1对宿主细胞的凋亡没有明显调控作用,对病毒基因组DNA的复制和基因转录也没有明显影响。 相似文献
3.
ie0基因是家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的一个晚期基因,该基因编码氨基酸序列的高度保守性及多种结构域提示其在病毒感染过程中的重要性。利用Red同源重组技术,分别对BmNPV ie0基因编码不同结构域的序列以及完整序列进行敲除构建ie0缺失型病毒,以野生型病毒为对照,研究ie0序列完全或部分缺失对病毒转录、复制及对宿主细胞致病能力等方面的影响。结果表明ie0基因完整序列或编码各结构域的序列缺失后均会对病毒产生不同影响:宿主细胞中完全缺失型和部分缺失型病毒滴度均有不同程度降低;完全缺失型和部分缺失型病毒基因组的拷贝数均与野生型病毒无显著差异;部分缺失型病毒的晚期和极晚期基因转录水平变化与ie0基因完全缺失型病毒相一致,均显著低于野生型病毒,并且缺失锌指结构域编码序列的影响最为明显。MTT检测结果也显示ie0基因完全缺失后病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。亚细胞定位显示IE0蛋白在细胞质、细胞核中均有分布,但主要位于细胞质。综上所述,ie0基因为BmNPV病毒增殖、基因组复制的非必需基因,但对病毒晚期和极晚期基因的转录具有调控作用,影响最为显著的为锌指结构域的编码序列,且该基因的缺失会导致病毒对宿主细胞的致病能力有所下降。 相似文献
4.
在昆虫杆状病毒的级联复制中,极早期基因ie-1所编码的IE-1蛋白具有重要功能,其中极晚期多角体蛋白基因启动子polh受其调控激活。通过建立具有启动子polh及ie-1长194 bp的反义序列(ie-1-r)的转录载体,使杆状病毒在宿主细胞进行自身复制时受到抑制。试验结果表明,当转入重组转录载体polh/ie-1-r的宿主细胞受携带荧光素酶(luciferase)基因的杆状病毒感染时,能够被诱导激活细胞内多角体蛋白基因启动子转录其携带的ie-1的反义序列RNA,从而部分抑制病毒本身的复制,宿主细胞在病毒感染第4～5天,其荧光素含量与对照RLU(relative light unit)相比下降约1×108个单位,抑制病毒的效果在时间上呈现一定的滞后性。试验结果提示:构建类似的病毒诱导表达系统,通过早期基因激活晚期基因,晚期基因转录抑制早期基因表达的策略,可以对病毒复制进行抑制。 相似文献
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昆虫杆状病毒的生活史中令人惊奇的现象之一是其极晚期基因多角体蛋白(polyhedrin, polh)基因的超高水平表达,表达产生的多角体蛋白将病毒粒子包埋到内部形成包涵体。本文根据已有的研究结果,从3个方面概括了polh基因超高水平表达的机制,即polh启动子的结构特征和转录调控、polh mRNA的结构和翻译调控以及影响polh基因表达的蛋白调控因子,期望有助于更好地理解polh超高水平表达调控的分子机制,为提高杆状病毒表达载体系统表达外源蛋白效率提供理论指导。 相似文献
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杆状病毒晚期表达因子(late expression factor,LEF)是参与病毒基因组DNA复制和病毒基因转录调控的一个重要家族,该家族成员LEF-11为13 k D的小分子蛋白质。通过比对目前已经测序的63种杆状病毒基因组序列,发现LEF-11的编码基因lef-11在除宿主为双翅目昆虫的Cuni NPV外的所有杆状病毒基因组中都存在,暗示lef-11基因可能在包括家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)在内的杆状病毒复制过程中行使重要功能。通过RT-PCR检测和Western blotting分析lef-11基因及其编码蛋白质在Bm NPV侵染的家蚕卵巢培养细胞Bm N中的转录与表达时相,其转录本从侵染后6h开始持续表达,蛋白质从侵染后12 h开始持续表达。当利用DNA聚合酶特异抑制剂阿非迪霉素(aphidicolin)阻断Bm NPV病毒基因组DNA复制之后检测LEF-11的表达受到抑制,暗示LEF-11的表达起始于病毒DNA复制之后。以上结果表明:BmNPV lef-11基因在杆状病毒中非常保守,是一个晚期表达基因,可能不直接参与病毒的起始复制,而是参与病毒的大规模复制过程。 相似文献
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晚期表达因子6(late expression factor 6,LEF-6)是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)复制的非必需因子,能促进病毒晚期基因的转录,提高病毒粒子的产量.BmNPV感染家蚕细胞前后的蛋白质乙酰化修饰差异组学结果显示,在病毒侵染过程中,LEF-6有2个赖氨酸残基(K85和K94)发生了乙酰化修饰.为了深入探究LEF-6乙酰化修饰在病毒侵染过程中的调控机制,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建lef-6敲除型(lef-6-KO-Bacmid)和补回型(lef-6-RE-Bacmid)的病毒,再利用定点突变技术将赖氨酸(K)突变为谷氨酰胺(Q)模拟乙酰化修饰,将赖氨酸(K)突变为精氨酸(R)模拟去乙酰化修饰,利用实时荧光定量PCR(qPCR)技术分析病毒基因组的复制情况.结果发现lef-6-KO-Bacmid型病毒基因组拷贝数显著下降,2个赖氨酸位点的乙酰化修饰对病毒基因组复制也具有显著抑制作用(P＜0.01),而去乙酰化修饰没有显著影响;病毒增殖能力检测和滴度分析结果也显示乙酰化修饰可以显著抑制病毒活力,降低子代病毒的产量;LEF-6乙酰化修饰对病毒晚期基因vp39转录具有显著抑制作用(P＜0.01);利用激光共聚焦显微镜技术分析LEF-6的亚细胞定位,发现乙酰化修饰后该蛋白主要定位在细胞质中.研究结果将为深入了解BmNPV与家蚕细胞之间的互作调控机制奠定基础. 相似文献
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Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。 相似文献
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用随机克隆法,克隆得到了柞蚕核型多角体病毒(Antheraeapernyinucleopolyhedrovirus,ApNPV)PstⅠ和XhoⅠ片段,经序列分析表明,该片段含有完整的晚期表达因子3(lef3),与其它来源的lef3基因具有很高的同源性。ApNPVlef3基因的阅读框为1110bp,编码369个氨基酸,编码一种DNA单链结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)。lef3基因参与病毒DNA复制,是病毒DNA复制必不可少的蛋白质因子。LEF3的N-端有一个氨基酸保守序列区,推测此氨基酸序列保守区是LEF3的主要功能区。在lef3基因上游的互补序列有一编码127个氨基酸序列的不完全阅读框,根据同源性比较,此阅读框与黄杉毒蛾核型多角体病毒(Orgyiapseudotsugatanucleopolyhedrovirus,OpNPV)的ORFs73编码相似的基因,而在该片段的3′端其序列与近缘种OpNPV和云杉卷叶蛾多角体病毒(Choristoneurafumiferananucleopolyhedrovirus,CfNPV)没有同缘性,显示了ApNPV基因组结构有其固有的特点。 相似文献
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基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。 相似文献
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通过电子显微镜观察 ,发现从野桑蚕体内分离的核型多角体病毒 (BmmNPV)经空斑筛选 ,其分离株的多角体外形和家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)的多角体外形呈现差异。对PCR扩增出的BmmNPV的多角体蛋白基因polh进行克隆、测序 ,并与BmNPV的polh序列比较 ,结果发现BmmNPV的polh在 +2 2、+70 3和 +711的 3个位点的碱基不同 ,使 +7位、+2 99位的Pro变成了Ser,+711位G变成为A ,而没有引起该位点 +2 31位Ala的改变。由Ser和Pro在形成蛋白二级结构的构象常数可以推测 ,BmmNPV的多角体较BmNPV更稳定 ,查明了多角体在外形存在差异的原因是ORF内碱基的差异引起的。 相似文献
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利用生物信息学方法预测家蚕核型多角体病毒基因组编码的miRNA 总被引：1，自引：1，他引：0
microRNAs(miRNAs)是长度为18～25 nt的非蛋白质编码小RNA分子,可以通过抑制有关基因mRNA的翻译从而调控机体的生长发育、疾病发生等过程。在很多病毒中发现有miRNA的存在,这些miRNA可能在病毒基因的表达以及与宿主的相互作用中发挥作用。利用vMir软件预测家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组可能编码的miRNA前体序列,对BmNPV基因组扫描分析后,得到7条能形成发夹结构的可能是miRNA的候选前体序列。以BmNPV添食感染5龄起蚕,72 h后取幼虫血淋巴提取总RNA,对这7条序列进行反转录PCR验证,其中扩增出的5条序列在BmNPV基因组中有相同的序列,推测这5条序列为BmNPV基因组编码的miRNA前体序列。进一步分析5条miRNA前体序列的发夹结构,并用反转录PCR的方法验证其成熟体序列,结果在5条miRNA前体序列共扩增出6条在BmNPV基因组中有相同序列的成熟体序列,它们分别位于不同的ORF之间,是BmNPV基因组编码的miRNA。利用在线靶基因预测程序RNAhybrid和RNA22预测到6条miRNA在BmNPV中的13个可能的靶基因,其中有6个靶基因是病毒的结构蛋白基因,2个为晚期表达因子基因,5个为未知功能基因。推测这些BmNPV基因组编码的miRNA可能与病毒感染宿主有关。 相似文献
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表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用 总被引：2，自引：2，他引：0
为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。 相似文献
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dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制效果 总被引：4，自引：4，他引：0
以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制必需的极早期基因ie-1和细胞释放型病毒CRV入侵关键基因gp64为靶序列,分别人工设计并体外转录出dsRNA I1(438 bp)和dsRNA G1(337 bp),用家蚕培养细胞BmN研究目标dsRNA对BmNPV复制、增殖的抑制效果。结果表明:dsRNA I1能有效地抑制BmNPV在BmN细胞中的增殖,最大抑制效果使培养液中的病毒滴度(TC ID50)比对照降低了104.30倍;dsRNA G1能显著地抑制新形成的病毒粒子的细胞侵染能力,最高可使培养液中的病毒滴度降低103.17倍。 相似文献
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斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(SpltMNPVⅡ)分离株是繁殖率和毒力极强的新型病毒株,ORF63是该病毒分离株的一个功能未知基因。从SpltMNPVⅡ分离株基因组中克隆了ORF63。序列分析表明,该基因读码框为1 071 bp,编码356个氨基酸,蛋白质分子质量为41.3 kD;起始密码子ATG上游存在一个早期和晚期启动子基序,编码蛋白序列含有CNX、MutH等多种结构域。启动子活性和转录时相分析表明ORF63是一个早、晚期表达的基因,在病毒感染4 h和18 h时有2个转录峰,24 h以后转录水平略有下降,但总体趋于稳定。构建该基因的原核表达载体pET-28a-ORF63,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体,Western blot检测制备的多克隆抗体特异性较好,效价可达1∶3 200以上。由以上结果推测,SpltMNPVⅡ分离株的ORF63基因是一个早期和晚期均有表达的病毒基因,可能与SpltMNPVⅡ感染宿主细胞后自身DNA的复制有关,参与早期芽生病毒(BV)的发生和晚期包涵体衍生病毒(ODV)的成熟2个过程。 相似文献