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1.
盘鲍原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫原性鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
为获得具有过敏原活性的重组盘鲍TM进行了试验。克隆盘鲍原肌球蛋白(tropomyosin,TM)基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行了鉴定。从盘鲍肌肉中提取总RNA,RT-PCR克隆盘鲍中原肌球蛋白基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增盘鲍TM的开放阅读框,与pET-28a载体连接并转化入大肠杆菌Escherichia.coli BL21(DE3),诱导表达后,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,West-ern-blot检测其免疫学活性。经序列测定,该基因由855个碱基组成,编码284个氨基酸。SDS-PAGE检测该重组蛋白在大肠杆菌中高效表达38 kD的目的蛋白,且重组蛋白具有良好的IgE结合活性。 相似文献
2.
采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株（Vibrio cholerae Y1）扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-corcgulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD 18-T载体.序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677).同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6％～ 99.7％和98.7％～ 99.1％,表明TcpA蛋白相当保守.将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为47.0 kD的重组TcpA融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测结果显示,重组TcpA融合蛋白可与鼠抗Vc Y1菌株菌毛蛋白抗血清发生特异性结合反应.用纯化的重组TcpA融合蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)制备抗血清,双相免疫扩散试验检测抗体效价达1:16,且该抗血清能够明显抑制Vc Y1菌株对HEp-2细胞的黏附.草鱼免疫后第25天用Vc Y1菌株攻毒,结果相对免疫保护率达到73.33％.研究结果表明,组TcpA蛋白仍保留着天然菌毛蛋白的免疫原性、免疫反应性和免疫保护性,重组TcpA蛋白可作为霍乱弧菌的候选诊断抗原和疫苗抗原. 相似文献
3.
对原核表达的重组建鲤组织蛋白酶L(Cathepsin L,CAT L)蛋白进行尿素洗涤和Ni-NTA亲和层析纯化,该目的蛋白经300 mmol/L咪唑洗脱为单一峰,SDS-PAGE结合TSK-GEL G2000SWxl凝胶过滤高效液相色谱分析表明重组CAT L获得了高度纯化,分子量约28 k D,纯度超过95%。Z-Phe-Arg-MCA底物测活法显示该重组CAT L表现为半胱氨酸蛋白酶活性,能与其内源抑制因子Cystatin以1︰1的摩尔比结合,具有生物学活性。以纯化的重组CAT L蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗血清,经ELISA法检测获得的CAT L抗血清效价高于1︰512000;Western blotting鉴定结果表明该抗体具有良好的特异性,能够识别原核表达的重组CAT L蛋白。免疫组织化学分析结果表明,该抗体还能识别建鲤小肠、肝胰脏、脾、背肌和心肌组织表达的内源性CAT L蛋白。因此可利用该抗体从蛋白水平检测CAT L在鱼类不同组织中的表达和分布情况。 相似文献
4.
为研究草鱼呼肠孤病毒(GCRV)HZ08株S10基因节段编码蛋白的可能功能,采用PCR方法扩增草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10基因节段,并把该基因节段克隆至表达载体pET-32a(+),获得的重组表达载体pET-32a-S10转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,表达产物通过SDS-PAGE分析鉴定后,再通过变性、过Ni柱纯化、透析复性纯化获得目的蛋白。然后用纯化的重组蛋白免疫昆明小白鼠,制得多克隆抗体,用间接ELISA方法测定抗体效价,用Western blot和IFA(间接免疫荧光试验)鉴定抗体特异性。结果表明,SDS-PAGE分析表达的重组蛋白约为53 ku,大小与预期相符,目的蛋白主要存在于包涵体中;过Ni柱纯化、透析复性纯化后的重组蛋白纯度可达97.4%;间接ELISA测得制备的多克隆抗体效价约为1∶106,Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能识别HZ08毒株,表明S10编码蛋白为GCRV-HZ08株的结构蛋白。 相似文献
5.
根据已登录的中华绒螯蟹一种Δ6去饱和酶基因(Accession Number:JX946434)及菁夜蛾去饱和酶基因(Accession Number:KJ622055.1)的保守区设计引物,通过逆转录PCR以及RACE技术克隆了中华绒螯蟹另一种Δ6去饱和酶基因FAD6-b的全长序列。经序列分析,中华绒螯蟹FAD6-b cDNA全长为2 310 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 326 bp,共编码442个氨基酸(Accession Number:KP876058),理论分子量为50.86 ku,理论等电点为8.47,FAD6-b基因的氨基酸序列与已公布的一条中华绒螯蟹Δ6去饱和酶基因的一致性为76%。原核表达载体构建及其表达实验表明,中华绒螯蟹FAD6-b基因成功重组到原核表达载体pCold-TF DNA中,重组质粒pCold TF-fad6b在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,经SDS-PAGE电泳分析表明,IPTG诱导后的重组菌出现了单一的蛋白条带,且大小与预期(105.86 ku)一致,可溶性分析显示目的蛋白主要存在于蛋白上清液中。对重组蛋白进行纯化,蛋白纯化液经电泳检测后显示出特异性单一条带,进一步证明了pCold TF-fad6b的成功构建和表达。目的蛋白经Western-blotting检测,结果表明获得的重组蛋白与6×His抗体进行了特异性结合,显示出良好的免疫学活性。 相似文献
6.
根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。 相似文献
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为进一步研究刺参甘露糖结合凝集素(AJ-MBL)的功能及提高刺参自身免疫力,对AJ-MBL基因的CDS区进行原核表达、纯化并初步鉴定其生物学活性。采用RT-PCR法扩增AJ-MBL基因编码区,经酶切鉴定、序列分析后,将其CDS区498 bp片段克隆至原核表达载体pET28a中,得到重组质粒pET-AJ-MBL。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并经IPTG诱导表达出分子量约17 ku的融合蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,用Ni2+离子亲和柱纯化。结果显示,获得高表达量的重组纯化蛋白。纯化的17 ku AJ-MBL进行红细胞凝集试验检测其生物学活性。凝集试验结果显示,AJ-MBL凝集最小浓度为10 μg/mL。本实验成功构建了AJ-MBL原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达了17 ku AJ-MBL蛋白,该蛋白具有良好的生物学活性。 相似文献
8.
应用RT-PCR方法扩增七带石斑鱼类胰岛素生长因子-Ⅰ(esIGF-Ⅰ)成熟肽序列。该成熟肽序列由210个碱基组成,编码70个氨基酸,包括B-C-A-D 4个结构域。将此成熟肽片段导入原核表达载体pET-28a上,在IPTG诱导下成功在E.coli BL21(DE3)中融合表达。SDS-PAGE分析表明,融合蛋白大小为11 ku,在IPTG诱导后3 h表达量最高,占菌体总蛋白的51.8%,重组蛋白主要以包涵体形式存在。对重组蛋白进行变性、纯化和复性,获得了纯化的重组蛋白。Western-blotting免疫印迹分析表明,融合蛋白可特异性地被6×His抗体识别。细胞增殖实验表明,纯化的IGF-Ⅰ融合蛋白能促使人乳腺癌细胞MDA231细胞增殖,表明具有生物活性。 相似文献
9.
鲶生长激素基因cDNA的克隆和原核表达 总被引：5，自引：0，他引：5
从脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR扩增并克隆到鲶鱼的生长激素(GH)基因cDNA。分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列,结果显示:鲶鱼生长激素基因的开放阅读框(ORF)包括603个核苷酸;编码200个氨基酸;其中包括22个氨基酸的信号肽和178个氨基酸的成熟肽。把GH成熟肽的cDNA克隆入表达载体pET-28 a,用IPTG诱导重组蛋白的表达,其表达量超过细胞蛋白总量的50%,主要为不溶性的包含体。细菌裂解液沉淀溶于8 mol/L尿素后,用固定化金属配体亲和层析纯化,获得分子量为22.5 kD的单一蛋白带。 相似文献
10.
为进一步了解哲罗鲑IGF-I,实验采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从哲罗鲑肝脏的总RNA中扩增出胰岛素样生长因子-I(IGF-I)的c DNA开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。利用原核表达载体p S构建重组表达质粒(IGF-I/p S),并将其转化到宿主大肠杆菌Rosetta后经IPTG诱导获得重组哲罗鲑IGF-I蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,在35~50 ku有条带与预期相符,且重组蛋白以包涵体的形式存在。包涵体经变性/复性实验后,获得纯化的IGF-I融合蛋白。ELISA鉴定结果显示,目的蛋白能特异性识别抗鱼类IGF-I抗体,表明获得了具有免疫活性的哲罗鲑IGF-I蛋白。细胞增殖实验(MTT法)结果显示,重组IGF-I蛋白对大麻哈鱼胚胎细胞(CHSE-214)、鲤上皮细胞(EPC)及虹鳟性腺细胞(RTG-2)均有显著促增殖作用,表明获得的重组IGF-I蛋白具有细胞水平的生物活性。本研究为深入了解IGF-I在哲罗鲑生长发育中的调控机制及绿色高效促生长制剂的研发奠定基础。 相似文献
11.
Hox基因（horneobox genes,同源异型盒基因）是一类含有同源框、参与动物早期胚胎发育的关键基因。其在胚胎发育中的表达水平对组织和器官的形成有重要的调控作用。脊索动物如文昌鱼（Branchiostoma floridae）有1个Hox基因簇,包括15个基因;哺乳动物有4个基因簇,各含有约13个Hox基因,位于4条染色体上;硬骨鱼类的连锁群更多,如斑马鱼（拉丁名）基因组中有7个Hox基因连锁群。分析不同鱼类的同源框基因家族（Homobox gene familv,Hox）的结构组成,揭示Hox基因家族在不同进化时间的进化动态和规律,以更好地阐释在新基因形成、物种分化以及维持遗传系统稳定性等作用,探讨DNA序列的同源性和不同物种间的亲缘关系,这对于保护生物多样性,尤其是遗传多样性、揭示生物进化历程及其机理具有参考意义。 相似文献
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为了解下丘脑神经肽(kisspeptin)在施氏鲟(Acipenser schrenckii)生殖调控中的作用,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术首次克隆得到施氏鲟2个kisspeptin基因的全长cDNA序列,命名为kiss1和kiss2,并对它们编码氨基酸序列的特征及时空表达模式进行分析。结果表明,施氏鲟kiss1基因的cDNA全长为522 bp,编码130个氨基酸;kiss2基因的cDNA全长为518bp,编码149个氨基酸;Kiss1和Kiss2均以α-螺旋和无规则蜷曲为二级结构中的主要元件,且为含有信号肽、无跨膜结构、分泌到细胞外的不稳定亲水性蛋白质。氨基酸序列比对及进化分析表明,施氏鲟Kiss1和Kiss2具有高度保守区域,与达氏鲟(Acipenser dabryanus)Kiss1和Kiss2蛋白序列一致性最高,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,施氏鲟kiss1和kiss2的表达具有组织特异性,其中kiss1在性腺中的表达量最高,而kiss2在脑中的表达量最高。kiss2在早期性腺发育过程中的表达量检测显示,在孵化后0～49 d, kiss2的表达量较低,而kiss1的表达量则较高,在孵化后21 d达峰值;随着性腺的发育(孵化后64～199 d), kiss2的表达水平逐渐升高并在139 d达到最高,随后下降;与kiss2表达模式不同, kiss1的表达量在孵化后184 d达到峰值。以上结果表明, kisspeptin基因在施氏鲟早期性腺发育过程中具有重要的作用,且其调控功能存在差异。本实验为进一步阐明kiss1和kiss2的生理功能和分子调控机制奠定了理论基础。 相似文献
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三疣梭子蟹细胞Cdk7基因克隆及其在卵巢发育中的表达 总被引：1，自引：1，他引：0
本实验应用RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)周期蛋白依赖性激酶7(Cdk7)基因c DNA序列全长。基因5′和3′非编码区域(UTR)以及开放阅读框的长度分别是23 bp、178 bp和1056 bp,预测编码一个含有351个氨基酸,分子量为39.91 k D的蛋白质,包含一个丝氨酸/苏氨酸催化保守结构域和T-loop结构。同源性分析表明,三疣梭子蟹CDK7氨基酸序列与其他物种Cdk7相似度较高,说明Cdk7基因具有很好的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,三疣梭子蟹Cdk7基因在卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。Cdk7基因在卵巢发育不同时期的表达量存在差异,其在I期和Ⅱ期的表达量显著高于其他时期(P0.05)。去除眼柄后该基因在卵巢组织中的表达呈现先升高后降低的趋势,并于第4天达到最大值。本研究的结果表明,Cdk7基因参与了三疣梭子蟹卵巢发育调控,为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物性腺发育调控机理研究提供了重要信息。 相似文献
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为研究促卵泡激素受体基因(FSHR)在施氏鲟(Acipenser schrenckii)性腺分化过程中的表达、分布及调控作用,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆得到施氏鲟促性腺激素(FSHR)基因的全长cDNA序列,并对其编码氨基酸序列的特征、基因表达及调控作用进行了分析。结果显示:施氏鲟FSHR基因的cDNA全长为2696 bp,编码661个氨基酸,属于含有信号肽、跨膜结构且分泌到细胞外的疏水性蛋白。氨基酸同源性及进化分析表明,施氏鲟与小体鲟(A.ruthenus)FSHR序列一致性最高,亲缘关系最近。PCR结果显示,FSHR mRNA的表达具有广泛性,各组织中均有表达,但在性腺、垂体中的表达量较高,显著高于其他组织中的表达量。LHRH-A注射实验显示:不同浓度组中,施氏鲟性腺组织中FSHR mRNA的表达量呈先升高后降低的变化趋势;与对照组相比,1μg/kg组在诱导3 d时性腺组织中FSHR mRNA的表达量达到最高,极显著高于3μg/kg和5μg/kg组。与性腺组织中FSHR mRNA表达模式不同,垂体中FSHR mRNA的表达呈升高后降低趋势,3μg/kg组在注射后第3天达最大值。综上结果表明,LHRH-A可通过调控FSHR的表达参与施氏鲟的早期性腺发育。 相似文献
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热休克蛋白70(HSP70)基因在中国对虾染色体上的定位 总被引：1，自引：0，他引：1
以热休克蛋白70(HSP70)基因为探针,利用荧光原位杂交(FISH)的方法,将其初步定位在中国对虾(Fenneropenaeus chinesis)染色体上。观察150组精巢细胞染色体,有111组染色体有3个杂交信号,占所观察的74％,由此得出,热休克蛋白70基因(HSP70)很可能存在于中国对虾减数分裂细胞3对染色体的3个位点上。本研究首次将功能基因定位在了对虾染色体上,为中国对虾的遗传物理图谱的构建提供了有效可行的方法。 相似文献
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大黄多糖对拟穴青蟹免疫相关基因表达的影响 总被引：1，自引：1，他引：0
运用RT-PCR技术探索拟穴青蟹(Scylla paramamosain)注射免疫增强剂——大黄多糖(rhubarb polysaccharide,RP)后11个免疫相关基因的表达变化情况。结果发现,大黄多糖刺激拟穴青蟹4 d后,血细胞中4个基因(丝氨酸蛋白酶抑制因子、过氧化氢酶、过氧化物还原酶和酚氧化酶原)表达水平分别上调1.1倍、4.1倍、1.3倍和2.1倍,与对照组相比,存在极显著(P0.01)或显著性差异(P0.05)。肝胰腺中5个基因表达变化显著(P0.05),其中丝氨酸蛋白酶抑制因子、过氧化物还原酶和抗脂多糖因子3个基因表达分别上调2.1倍、4.8倍和1.7倍;过氧化氢酶和溶菌酶仅在实验组中表达,未见其在对照组表达。由此推测,丝氨酸蛋白酶抑制因子、过氧化氢酶、过氧化物还原酶、酚氧化酶原、抗脂多糖因子和溶菌酶6个基因可能与拟穴青蟹免疫增强有关。 相似文献
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为研究乌鳢诺卡氏菌的致病机理,本实验通过病原分离鉴定、组织病理学和基因表达水平分析对病原菌的致病性、药物敏感性及乌鳢的免疫抗性进行了研究。结果显示,患病乌鳢主要感染了命名为SDAT 0011病原菌,通过菌落形态观察、革兰氏染色鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA鉴定及诺卡氏菌特异序列扩增鉴定,结果均显示该病原菌为诺卡氏菌。将分离的SDAT 0011感染健康乌鳢后,1×105～1×108 CFU/mL注射组的死亡率均为100%,感染乌鳢出现明显的诺卡氏菌病症状,如内脏出血,肝脏、脾脏和肾脏中有大量大小不等的结节,组织病理切片进一步检测发现,结节分界清晰,结节中有大量的淋巴细胞、受损或死亡的组织细胞。药物敏感性实验发现,诺卡氏菌对利福平等抗生素较为敏感,对青霉素等具有较强的抗性。基因表达分析显示,在感染初期(48 h)及中后期,Toll样受体2基因(TLR2)和Toll样受体13基因(TLR13)在脾脏和头肾的表达水平显著上调,而趋化因子受体9基因(CCR9)在脾脏和头肾中显著下调,这表明乌鳢Toll样受体和趋化因子受体信号通路可能在其抵抗诺卡氏菌感染中起重要作用。本实验为乌鳢诺卡氏菌病的... 相似文献
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自环洞庭湖区精养鱼池患病草鱼肠道中分离获得4种病原菌,进行16S rRNA基因和gyrB基因序列测定和在线比对,并对草鱼进行回归感染。随后进行4种病原菌的药敏特征、溶血活性试验,并利用PCR方法检测了6种毒力因子的携带情况。试验结果表明,病原菌分别为温和气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌、类志贺邻单胞菌和格氏乳球菌;4种病原菌回归感染草鱼,均能使草鱼患病致死,自死亡的草鱼体内均能分离得到相应感染的病原菌;4种病原菌对多种抗生素具有耐药性,且在脱纤维绵羊血血平板上检测到了温和气单胞菌、异常嗜糖气单胞菌AaB007的溶血活性;PCR结果表明,4种病原菌携带多种毒力因子。研究结果可为环洞庭湖区草鱼精养鱼池健康养殖及病害防治提供科学依据。 相似文献
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为了研究Smad基因在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Smad3(命名为Es Smad3)的cDNA全长序列2021 bp,包括36 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、656 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码442个氨基酸的开放阅读框。蛋白质结构域分析显示EsSmad3含有MH1和MH2两个特征性保守结构域。多序列比对显示,EsSmad3与人、斑马鱼、黑腹果蝇中的同源蛋白序列一致性分别为0.679、0.691、0.619。应用荧光定量RT-PCR技术分析EsSmad3在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Smad3在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中眼柄和精巢中表达量较高,心脏和肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期的不同部位的肌肉中,Es Smad3表达量变化不同:步行足肌肉组织中EsSmad3 mRNA表达在蜕壳间期高于蜕壳前D_(3–4)期和蜕壳后A~B期,但无显著的统计学差异(P0.05)。螯足肌肉在蜕壳前晚期D_(3–4)期急剧下调(P0.05),蜕壳后A~B期开始表达量显著升高(P0.05),直至蜕皮间期C期。腹部肌肉组织中EsSmad3m RNA水平在蜕皮间期C期显著高于蜕壳后A~B期,这种上调一直持续到蜕壳前晚前期D_(3–4)。上述结果表明,Es Smad3在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达模式与蜕皮周期密切相关,推测Es Smad3参与了中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。 相似文献