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1.
应用RT-PCR方法扩增出猪日本乙型脑炎病毒（JEV）的NS1基因,通过Sal Ⅰ＋EcoR Ⅰ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中.重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确.将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒.PCR鉴定及间接ELISA检测的结果证明所构建的重组腺病毒成功地表达了JEV的NS1. 相似文献
2.
本试验旨在构建甲型H7N9流感病毒非结构蛋白（NS1）真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的NS1蛋白。首先提取安徽分离株甲型H7N9流感病毒（A/Anhui/3/2013(H7N9)）的总RNA,通过RT-PCR技术获得了甲型H7N9流感病毒H7N9 NS1全长基因,然后将其克隆至载体pcDNA4-Flag-HA中构建pcDNA4-Flag-HA-NS1真核重组表达载体,经酶切及测序鉴定正确后将质粒pcDNA4-Flag-HA-NS1转染到293T细胞中,通过Western blotting鉴定NS1蛋白的表达。结果表明成功克隆了NS1全长基因,构建了甲型H7N9流感病毒NS1蛋白真核表达载pcDNA4-Flag-HA-NS1,并在293T细胞中转染表达,Western blotting确定了NS1蛋白的成功表达。该表达载体的成功构建及在293T细胞中成功表达NS1蛋白,为后期开展流感病毒NS1蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。 相似文献
3.
《中国家禽》2017,(18)
为利用分段表达载体鉴定禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白单克隆抗体识别区域,构建ALV衣壳蛋白p27全长及分段真核表达载体。将实验室保存的pGEX-6p-1-p27质粒双酶切亚克隆到pcDNA3.1真核表达载体中,构建pcDNA3.1-p27全长表达质粒。同时设计引物,扩增p27基因1~480 bp的A片段以及241~720 bp的B片段,构建pcDNA3.1-p27A和pcDNA3.1-p27B分段表达载体,并在DF-1细胞中暂态表达,利用IFA和Western blot方法鉴定病毒衣壳蛋白单克隆抗体的识别区域。结果表明:重组质粒均能正确表达,并鉴定出两株单克隆抗体5D3和4F12的抗原识别区域均位于衣壳蛋白p27蛋白碳端161~240位氨基酸区域。研究成功构建并表达了ALV衣壳蛋白p27的全长和分段真核表达载体,并利用分段表达质粒鉴定了两株单克隆抗体的抗原识别区域,为深入研究衣壳蛋白p27的生物学功能提供了生物材料。 相似文献
4.
[目的]获取羊口疮病毒B2L基因编码蛋白。[方法]根据GenBank上羊口疮病毒ORFV/ShanXi/2011/China株B2L基因序列,设计并合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增B2L全基因序列,然后将扩增的B2L基因克隆到PMD18-T载体上;对构建的重组克隆质粒(PMD18-T-B2L)经过测序鉴定后,将目的基因亚克隆到PET-32a(+)原核表达载体上,获得重组表达质粒PET-32a-B2L,然后通过双酶切和测序进行鉴定;将重组菌于37℃、终浓度含1 mM IPTG的LB培养基中,诱导表达3h后进行SDS-PAGE分析;表达的目的蛋白经过层析纯化后,进行Western Blot鉴定。[结果]原核表达重组质粒构建成功;SDS-PAGE鉴定发现目的条带的分子量与预期大小相符;纯化的目的蛋白经Western Blot鉴定正确,表明蛋白表达成功。[结论]本研究成功构建了羊口疮病毒B2L基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了B2L蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立打下了基础。 相似文献
5.
根据已发表的番鸭细小病毒(MDPV)核苷酸序列设计并合成1对引物,对MDPV非结构蛋白NS2基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.4 kb。将该片段直接与pMD18-T载体连接,转化入感受态大肠杆菌DH5α中增殖。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增及BamH I酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶BamH I和Sal I进行双酶切鉴定。将克隆产物pMD18-T-NS2与原核表达载体pET-32a分别用BamH I和SalI双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5α中。对所获得的重组质粒分别经BamH I单酶切、BamH I和Sal I双酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功构建了含有MDPV NS2非结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。 相似文献
6.
《中国兽医学报》2016,(3)
为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的真核表达,首先经PCR扩增了σNS基因的完整编码序列(CDS),连接到携带有flag标签的真核表达载体pCI-neo-flag,双酶切鉴定及序列测定表明成功构建了重组表达质粒pCI-flag-σNS,使用ViaFect转染试剂将其转染至DF-1细胞,采用半定量RT-PCR法检测σNS基因的转录水平,Western-blot分析σNS蛋白的表达。RT-PCR结果显示,σNSmRNA水平在转染后0~36h逐渐递增,48h时出现下降;Western-blot鉴定结果显示,重组σNS蛋白与flag鼠单克隆抗体和MDRV-σNS兔多克隆抗体均能发生特异性反应;以上结果均表明MDRV-YBσNS基因在DF-1细胞中得到了正确的表达,为后续蛋白功能研究奠定了基础。 相似文献
7.
《畜牧兽医科技信息》2020,(6)
本试验旨在克隆A型流感病毒H7N9株的PA和PAX基因并构建真核表达载体对其进行真核表达。从苏州分离株的鸡胚尿囊液中提取禽流感病毒RNA,通过RT-PCR技术获取PA以及PAX全长基因,经琼脂糖凝胶电泳获得纯化的目的基因;构建目的基因重组真核表达质粒,并利用双酶切及测序鉴定重组质粒;质粒DNA转染293T细胞真核表达,让其表达的蛋白产物通过Western Blot鉴定。其结果成功地在293T细胞内表达了PA与PAX蛋白,为进一步研究A型流感病毒PA与PAX蛋白的功能奠定了基础。 相似文献
8.
《甘肃畜牧兽医》2021,51(9)
目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。 相似文献
9.
为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。 相似文献
10.
为了探讨融合microRNA重组干扰载体构建的方法,为今后mi R-150对猪瘟病毒(CSFV)潜在的调控进行研究,利用生物信息学技术筛选出mi R-150,设计并合成了表达mi R-150的两条shRNA序列的DNA单链,将其退火后与干扰载体pGenesil-1连接,构建了含有mi R-150shRNA和绿色荧光蛋白基因的重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,提取并纯化质粒后,采用脂质体法将重组质粒转染PK-15细胞,用G418抗性筛选。经过酶切鉴定和测序鉴定,表明成功构建了重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,并在转染24 h后即可检测到绿色荧光。本研究成功得到稳定表达mi R-150的细胞株,所建的方法可以应用于各种microRNA的构建。 相似文献
11.
利用DNAStar Protean模块预测分析水貂阿留申病毒（aleutian disease virus,ADV）NS1基因后,设计3对特异性引物,以吉林农业大学经济动物实验室保存的NS1全长克隆质粒NS1-pMD18-T为模板扩增NS1基因的3个截短片段,分别命名为L1N1、L2N2、L3N3基因,构建克隆质粒pMD18-T-L1N1、pGEM-T-L2N2及pMD18-T-L3N3。经测序鉴定正确后,将经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的3个NS1基因片段连接至经相同双酶切的pGEX-4T-1原核表达载体,并转化入表达宿主菌BL21（DE3）感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blotting检测重组菌在大肠杆菌中的表达情况。结果表明,成功构建了3段重组原核表达质粒pGEX-4T-L1N1、pGEX-4T-L2N2、pGEX-4T-L3N3,SDS-PAGE结果显示分别表达出大小约57、51、44 ku的目的条带,与预期相符。Western blotting 进一步证实获得的3种蛋白能被ADV阳性血清识别,具有反应原性。本试验首次对ADV NS1基因在大肠杆菌中进行分段表达,为后续研制ADV的亚单位疫苗奠定基础。 相似文献
12.
为了对微小隐孢子虫(C.parvum)类钙调蛋白(CML)基因进行原核表达,分析重组表达蛋白的反应原性。以C.parvum卵囊cDNA为模板,用PCR方法扩增得到C.parvum CML基因。将CML基因连接到克隆载体pMD18-T,获得重组质粒pMD-CML,经限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,连接到经相同内切酶酶切的表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达。利用GST亲和树脂法纯化重组表达蛋白,对纯化的重组蛋白进行Western blot分析。结果表明,成功构建了重组原核表达质粒pGEX-CML,重组质粒转化菌经IPTG诱导后成功地表达出了分子质量约为51ku的重组蛋白rCML,纯化的蛋白rCML能与感染兔隐孢子虫(C.cuniculus)的兔血清发生特异性反应,具有很好的反应原性。 相似文献
13.
在293细胞中瞬时表达A/Chicken/Henan/1001/2010（H9N2）NS1基因蛋白,并对表达蛋白活性进行测定。试验利用PCR技术从NS1-T载体质粒上扩增NS1基因,将其克隆至pCAGGS载体,构建重组质粒NS1-pCAGGS;经酶切和测序鉴定正确后,重组质粒NS1-pCAGGS与脂质体按照一定比例混合后转染293细胞,用间接免疫荧光方法对瞬时表达细胞进行荧光信号反应。结果显示,禽流感NS1基因可以很好地在293细胞中瞬时表达,具有良好的反应原性。 相似文献
14.
目的将小反刍兽疫病毒M蛋白基因截短表达后用于特异性单抗制备及临床抗体水平检测。方法:用在线分析软件BepiPred分析小反刍兽疫病毒M蛋白潜在的B细胞线性表位,以本实验室构建的pCR2.1T-PPRV M质粒为模板,扩增三段截短的M基因,纯化后的PCR产物分别与克隆载体pCR2.1T连接,筛选出的阳性重组质粒经双酶切后,分别与表达载体pET-32a(+)及pGEX-6p-1连接,再将鉴定为阳性的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)菌株诱导表达,并用SDS-PAGE及Western blot验证。结果 PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段。对连接克隆载体及表达载体的重组质粒双酶切后,均出现与预期一致的片段,DNA测序表明,插入片段序列与小反刍兽疫Nigeria75/1株M蛋白基因完全一致。重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明所构建的重组蛋白均获得高效表达,并均具有良好的反应原性。结论成功表达了小反刍兽疫截短M基因的蛋白,为制备特异性单抗及小反刍兽疫抗体检测奠定了一定基础。 相似文献
15.
猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。 相似文献
16.
《畜牧与兽医》2015,(6):7-11
根据猪瘟病毒衣壳蛋白(Core)基因序列设计一对特异性引物,RT-PCR从猪瘟兔化弱毒中扩增出完整的Core基因,经酶切和序列测定后,克隆到携带His标签的原核表达载体p ColdⅠ中,成功构建了重组质粒p Cold-Core,并转化到大肠杆菌Rosseta 2(R2)中;利用IPTG诱导表达目的蛋白并鉴定表达效果。结果表明:经终浓度为0.1 mmol/L IPTG诱导24 h后,Core基因在R2中获得分泌性可溶表达,表达量占菌体蛋白的32.6%,SDS-PAGE显示目的蛋白相对分子质量为20 ku。Western blot结果显示Core蛋白可以分别与His单抗和猪瘟病毒阳性抗血清发生特异性反应,均出现单一反应带。将目的蛋白切胶后免疫Balb/c小鼠,制备特异性抗血清,Western blot结果显示该抗血清与衣壳蛋白反应后有明显的特异性条带,经激光共聚焦鉴定抗血清能够与胞浆中的猪瘟病毒粒子发生反应。结果表明,Core基因表达成功,制备的抗血清具有生物学功能。本研究为深入探讨Core蛋白在猪瘟病毒致病机制上的作用奠定了基础。 相似文献
17.
H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达 总被引：4，自引：0，他引：4
利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析.结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B.再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1.经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21（DE3）（pLysS）感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白.用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性. 相似文献
18.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(5)
为了探究由干扰素刺激基因15(ISG15)编码产生的ISG15蛋白的表达特性,及其对犬瘟热病毒(CDV)感染过程的影响,以及在CDV致宿主免疫抑制过程中的作用,试验设计并合成了针对ISG15基因的特异性引物,提取宿主细胞总RNA,反转录成cDNA后利用RT-PCR方法扩增ISG15全基因序列,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测、回收纯化目的片段后将其插入到pEGFP-N1真核表达载体中,构建pEGFP-ISG15重组质粒。PCR和双酶切鉴定重组质粒后测序,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞中进行荧光显微镜观察和Western-blot分析。结果表明:经PCR扩增和双酶切鉴定得到与目的片段大小相符的片段,且测序结果证实重组质粒pEGFP-ISG15构建成功,转染HEK293T细胞24 h后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光信号,Western-blot可检测到与目的蛋白大小一致的融合蛋白。说明试验构建的重组质粒pEGFP-ISG15可在体外成功表达ISG15蛋白。 相似文献
19.
羊口疮病毒ORF129基因的原核表达、纯化及鉴定 总被引：1，自引：0，他引：1
试验旨在克隆羊口疮病毒ORF129基因,并对其编码蛋白进行表达及纯化。参照GenBank已发表羊口疮病毒OV-IA82株ORF129基因序列(登录号:AY386263.1),用Primer Premier 5.0软件设计合成1对特异性引物,利用PCR方法扩增ORF129全基因序列,将其与质粒pET-28a(+)经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接,构建重组质粒pET-28a(+)-ORF129。重组质粒经双酶切和测序鉴定后转化大肠杆菌Rosttta感受态细胞,利用IPTG诱导ORF129基因的表达,经SDS-PAGE分析后,将表达产物超声破碎、洗涤、溶解,然后采用尿素梯度透析方法进行复性,经亲和层析法纯化目的蛋白并通过Western blotting对其进行鉴定。双酶切鉴定和测序结果表明,本试验成功构建了重组质粒,读码框正确,菌液起始D600nm值为0.4~0.8,37℃、220r/min、1mmol/L IPTG诱导3h时能得到ORF129包涵体蛋白,蛋白大小为58ku,在加入精氨酸、甘油的复性液中,蛋白复性率较高,将复性后蛋白与Ni柱结合,在咪唑浓度为500mmol/L时,能将蛋白洗脱,纯化的蛋白经Western blotting鉴定正确,证明蛋白成功表达。本研究成功构建了羊口疮病毒ORF129基因原核表达重组质粒,并成功表达和纯化了ORF129蛋白,为后续羊口疮病毒检测方法的建立奠定基础。 相似文献
20.
采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒（GPV）的检测抗原，利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VPl与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP（1-3），分别转染sf9细胞，得到重组病毒，分别表达出了54ku的NS2融合蛋白和24ku的VP（1-3）融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实，表达产物具有特异性；间接免疫荧光试验证实，重组蛋白在细胞中获得了表达。 相似文献