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1.
为了建立青海藏羊巨型住肉孢子虫体外培养方法,以贴壁生长和形态完整的非洲绿猴肾细胞(Vero)作为宿主细胞,将青海藏羊巨型住肉孢子虫缓殖子(1.25×104个/mL)接种于宿主细胞,连续培养21d,期间观察记录其生长发育状况。结果表明,藏羊巨型住肉孢子虫在Vero细胞中生长良好,并在培养液中观察到游离的虫体卵囊,21d后均可分离、纯化出新一代的缓殖子。说明在实验室条件下,成功建立了藏羊巨型住肉孢子虫稳定的体外培养方法。 相似文献
2.
《中国兽医学报》2019,(9):1753-1757
应用青蒿素、桦褐孔菌多糖、黄芩苷及乙胺嘧啶等药物对Vero细胞中培养的犬新孢子虫进行了体外抑制试验。结果显示,青蒿素、桦褐孔菌多糖、黄芩苷、乙胺嘧啶均有抑制虫体的效果,尤其青蒿素在高浓度试验组中抑虫效果最为明显,质量浓度为20 mg/L时的抑制率为95.17%,Vero细胞形态较为完整,虫体组织包囊体积最小、数量均最少;桦褐孔菌多糖(25 mg/L)、黄芩苷(20 mg/L)和乙胺嘧啶(1.25 mg/L)高质量浓度时的抑虫效果相近。结果表明,青蒿素、桦褐孔菌多糖、黄芩苷和乙胺嘧啶均可以作为抗新孢子虫的潜在药物,其中桦褐孔菌多糖为天然药物提取物,在抗新孢子虫药物中更具有研究价值。 相似文献
3.
吉林株犬新孢子虫的分离与鉴定 总被引：5，自引：1，他引：4
将疑似感染犬新孢子虫而流产的牛胎儿脑组织接种于Vero细胞进行体外培养,同时感染长爪沙鼠进行动物试验.提取牛流产胎儿脑组织DNA、沙鼠脑组织DNA、细胞培养虫体DNA,用犬新孢子虫特异性引物进行PCR扩增.结果显示,PCR扩增出了1条约为681 bp的目的条带;测序结果表明,扩增出的特异性目的基因序列与GenBank中发表的犬新孢子虫NcSAG1基因(AF113004)核苷酸序列的同源性为99.4%.结果表明,在吉林省牛流产胎儿脑组织中分离出犬新孢子虫. 相似文献
4.
为了解犬新孢子虫Nc-GFP株的生物学特性,本试验采用Vero细胞培养的犬新孢子虫速殖子,腹腔接种BALB/c小鼠,观察小鼠的临床症状及发病情况,脱颈处死濒死期小鼠,无菌分离小鼠脑组织,接种Vero细胞进行连续培养,并提取脑组织DNA进行NcMAG1基因的PCR鉴定。结果显示:BALB/c小鼠接种犬新孢子虫Nc-GFP株速殖子后,先后出现被毛逆立、共济失调等临床症状;小鼠脑组织接种Vero细胞14 d后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光的犬新孢子虫Nc-GFP株速殖子和包囊;小鼠脑组织经NcMAG1基因的PCR检测,扩增出1 047 bp的目的基因条带,经测序与GenBank中发表的NcMAG1(EF580924.1)核苷酸序列的同源性为99.6%。本试验成功地从BALB/c小鼠脑组织中分离出了犬新孢子虫Nc-GFP株,为Nc-GFP株生物学特性的深入研究奠定了基础。 相似文献
5.
《中国预防兽医学报》2020,(9)
Sec62/Sec63是位于内质网膜上的跨膜蛋白复合物,辅助新合成的前体蛋白或新生多肽链转运至内质网,进行后期的折叠加工。为研究Sec62/Sec63复合物对乙型脑炎病毒(JEV)复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别构建SEC62、SEC63基因敲除的HEK-293细胞系,经测序鉴定以及western blot检测,获得两个基因敲除细胞系,分别命名为SEC62 KO HEK-293细胞和SEC63 KO HEK-293细胞。分别以MOI为1、0.05的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,利用间接免疫荧光试验检测Sec62/Sec63复合物对JEV复制的影响。结果显示,不同剂量JEV感染SEC62 KO HEK-293细胞与SEC63 KO HEK-293细胞中荧光信号阳性细胞均少于HEK-293细胞对照组;以MOI为1的JEV感染HEK-293、SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞后,经western blot检测,结果显示于感染后12 h、24 h和48 h,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞中均未检测出JEV E蛋白条带,而对照HEK-293细胞中JEV E蛋白的表达量逐渐增加。以MOI为1的JEV感染上述3种细胞后检测细胞培养液中病毒滴度,结果显示JEV感染12 h后SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞与HEK-293细胞病毒滴度无差异(p0.05),而感染后24 h与48 h时,SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p0.01)。以MOI为1、0.5、0.05的JEV感染上述3种细胞后检测48 h后细胞培养液中病毒滴度,结果显示SEC62 KO HEK-293、SEC63 KO HEK-293细胞培养液中病毒滴度均显著低于HEK-293细胞对照组(p0.001)。以上结果表明,SEC62、SEC63基因敲除后均抑制了JEV的复制,也表明Sec62、Sec63是影响JEV在细胞内复制的重要宿主因子。本研究为进一步探究Sec62、Sec63等宿主因子对JEV复制的影响机制提供了参考依据。 相似文献
6.
为建立牛源犬新孢子虫孕鼠感染模型,深入研究牛源犬新孢子虫对孕鼠的致病作用,本试验以雌性BALB/c小鼠为试验动物,分离Vero细胞中培养的牛源犬新孢子虫速殖子,分不同剂量组腹腔接种雌性BALB/c小鼠后,与雄性BALB/c小鼠合笼,每天观察小鼠临床症状和发病情况,观察主要脏器组织的病理变化,应用PCR方法检测孕鼠脑、肝脏、脾脏等脏器组织及胎盘中犬新孢子虫Nc5基因,并测定孕鼠胎盘湿重和胎盘系数。结果显示,感染模型小鼠的最佳攻虫剂量为105个虫体;感染犬新孢子虫孕鼠先后出现精神不振、共济失调等临床症状,并有不同程度死亡;病理学观察模型小鼠脑、肝脏、脾脏等脏器组织出现充血、出血、肿大等病理变化;在模型小鼠脑、肝脏、脾脏等脏器组织及胎盘中检测到犬新孢子虫Nc5基因;随攻虫天数的增加,模型小鼠胎盘重量和胎鼠重量均不断增加,胎盘系数逐步降低,在第12、14、16天时,模型组与对照组相比,胎盘重量和胎盘系数均差异显著（P < 0.05）。本试验成功建立了牛源犬新孢子虫孕鼠感染模型,为犬新孢子虫致病机制研究奠定了基础。 相似文献
7.
为了解牛源犬新孢子虫MAG1基因的生物学特性,本实验应用PCR技术扩增牛源犬新孢子虫MAG1基因,构建真核表达重组质粒pVAX-MAG1,将鉴定正确的pVAX-MAG1重组质粒转染Vero细胞,应用间接荧光检测方法(1FA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫MAG1基因长度为1047bp,与GenBank中登录的MAG1 (EF580924.1)核苷酸序列同源性为99％,IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,western blot分析表达蛋白的分子量为39 ku,具有较好的反应原性.本实验为新孢子虫病核酸疫苗与诊断试剂盒的研究奠定了基础. 相似文献
8.
泰氏锥虫体外培养的研究 总被引：1，自引：0，他引：1
中试验证明泰氏锥虫在Vero、IBRS一2传代细胞,长爪沙土乳鼠、乳兔仔原代和继代细胞上均能生长繁殖,并能连续继代。尤其在长爪沙土乳鼠肾细胞培养物上,繁殖最为迅速。选用敏感细胞连续培养,方法简便,虫体产量高,成本低,虫体悬液含宿主细胞、血清成份少。虫体在敏感细胞上3～4天,悬液中虫体数达最高峰。按期收集虫体悬液,再换入新的营养液,可使虫体在细胞培养物上继续生长繁殖(连续培养法,又称倒茶水法),同一细胞培养物能收集虫体悬液5～8次。细胞培养物经带虫传代又可继续上述培养过程。虫体生长繁殖的最适pH为7.0～7.2,培养最适温度36℃,抗菌素(尤其是两性霉素B)对虫体有杀伤作用。 相似文献
9.
表达牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析 总被引：1，自引：0，他引：1
为构建牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒,并分析其免疫原性,PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSRS2基因,构建克隆质粒pMD18-T-NcSRS2、重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcSRS2及表达质粒Transpose-AdNcSRS2,脂质体介导转染QBI-HEK293细胞,包装重组腺病毒Ad5-NcSRS2,PCR检测重组腺病毒NcSRS2基因,IFAT和Western blotting检测NcSRS2基因在QBI-HEK293细胞中的表达,测定病毒滴度后,收集病毒液免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清IgG抗体水平.结果显示,扩增的牛源犬新孢子虫NcSRS2基因大小为1 227 bp,与GenBank中发表的NcSRS2( AF061249)核苷酸序列相似性为99％;重组腺病毒Ad5-NcSRS2在293细胞中包装成功,表达蛋白的相对分子质量为43 ku,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSRS2滴度为109TCID50·mL-1,间接ELISA检测二免后3周BALB/c小鼠血清中IgG抗体效价达1 ∶ 2 048.本研究成功构建了具有良好免疫原性的重组腺病毒Ad5-NcSRS2,为牛源犬新孢子虫NcSRS2基因重组腺病毒载体疫苗的研制奠定了基础. 相似文献
10.
为建立牛源犬新孢子虫孕鼠感染模型,深入研究牛源犬新孢子虫对孕鼠的致病作用,本试验以雌性BALB/c小鼠为试验动物,分离Vero细胞中培养的牛源犬新孢子虫速殖子,分不同剂量组腹腔接种雌性BALB/c小鼠后,与雄性BALB/c小鼠合笼,每天观察小鼠临床症状和发病情况,观察主要脏器组织的病理变化,应用PCR方法检测孕鼠脑、肝脏、脾脏等脏器组织及胎盘中犬新孢子虫Nc5基因,并测定孕鼠胎盘湿重和胎盘系数。结果显示,感染模型小鼠的最佳攻虫剂量为105个虫体;感染犬新孢子虫孕鼠先后出现精神不振、共济失调等临床症状,并有不同程度死亡;病理学观察模型小鼠脑、肝脏、脾脏等脏器组织出现充血、出血、肿大等病理变化;在模型小鼠脑、肝脏、脾脏等脏器组织及胎盘中检测到犬新孢子虫Nc5基因;随攻虫天数的增加,模型小鼠胎盘重量和胎鼠重量均不断增加,胎盘系数逐步降低,在第12、14、16天时,模型组与对照组相比,胎盘重量和胎盘系数均差异显著(P0.05)。本试验成功建立了牛源犬新孢子虫孕鼠感染模型,为犬新孢子虫致病机制研究奠定了基础。 相似文献
11.
本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒(canine parovirus,CPV)基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型;采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性;经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列,将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接;分别构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H,将载体共转染HEK-293细胞,采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性;采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量;用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定;间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示,CPV单克隆抗体亚型为IgG_(2b),亲和力常数6个Ka平均值为1.02×10~(11) L/mol,只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示,试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-L和pcDNA3.1(+)-H;HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶2~4和1∶2~6,中和试验结果显示,HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290;鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L,SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带,表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明,纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体,为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。 相似文献
12.
3只临床表现斜颈、麻痹和打滚的病兔,经病理组织学检查诊断为脑炎原虫病.取其脑组织制成乳剂,接种于兔肾细胞、Vero细胞、猫肾细胞和兔脉络丛细胞.用前3种细胞均分离出原虫.该虫体表现为多种形态,呈杆状、圆形或卵圆形;Gram染色呈阳性,Goodpasture氏染色呈红色.用20%H_2O_2处理虫体,在相差显微镜下见到虫体极丝的伸展.通过虫体的形态学、染色特征和极丝的突出实验,鉴定该虫体为脑炎原虫.兔肾细胞、Vero细胞和猫肾细胞的感染率分别为40%、40%和5%,而在兔脉络丛细胞原代培养物中未检查到虫体. 相似文献
13.
《中国兽医学报》2014,(12):1931-1934
为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。 相似文献
14.
《中国预防兽医学报》2015,(5)
为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。 相似文献
15.
本研究旨在利用HEK-293细胞系制备鼠源犬细小病毒（canine parovirus，CPV）基因工程抗体并检测其生物活性。通过抗体亚型检测试剂盒检测CPV单克隆抗体亚型；采用间接ELISA检测CPV单克隆抗体的亲和力和特异性；经RACE-PCR获得CPV单克隆抗体的可变区序列，将可变区序列与鼠源抗体恒定区序列连接；分别构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H，将载体共转染HEK-293细胞，采用血凝抑制与中和试验的方法检测鼠源CPV基因工程抗体生物活性；采用HEK-293F细胞悬浮表达并用间接ELISA方法检测鼠源CPV基因工程抗体的表达量；用Protein A亲和层析柱纯化鼠源CPV基因工程抗体后进行SDS-PAGE鉴定；间接免疫荧光检测纯化后鼠源CPV基因工程抗体的活性。结果显示，CPV单克隆抗体亚型为IgG2b，亲和力常数6个Ka平均值为1.02×1011 L/mol，只与CPV VLPs发生反应。琼脂糖凝胶电泳结果显示，试验成功构建真核表达载体pcDNA3.1（+）-L和pcDNA3.1（+）-H；HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液血抑效价分别为1∶24和1∶26，中和试验结果显示，HEK-293和HEK-293F细胞培养上清液中和效价分别为1∶152和1∶1 290；鼠源CPV基因工程抗体在HEK-293F细胞中的表达量为5.97 mg/L，SDS-PAGE分析在55和25 ku处出现条带，表明鼠源CPV基因工程抗体成功在HEK-293F细胞中表达并纯化。间接免疫荧光检测结果表明，纯化后鼠源CPV基因工程抗体具有良好的生物活性。本研究在HEK-293F细胞中成功表达具有中和活性、纯度较高的鼠源CPV基因工程抗体，为今后CPV基因工程抗体药物的研发奠定基础。 相似文献
16.
为对犬孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒进行免疫学评价,本实验以含有MAG1-IFN-γ基因片段的克隆质粒为模板,扩增MAG1-IFN-γ目的片段,构建pVAX-MAG1-IFN-γ重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达,并免疫BALB/c小鼠,进行免疫学评价。结果表明,PCR扩增获得基因片段大小为1 536 bp,与GenBank中登录的MAG1和IFN-γ核苷酸序列的同源性为99%;IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,转染的Vero细胞呈现特异性绿色荧光;western blot分析表达蛋白的分子量为57 ku,具有较好的反应原性。将构建的重组真核表达质粒免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和T淋巴细胞亚群含量测定表明,重组质粒具有较好的免疫原性。本实验为新孢子虫病核酸疫苗的深入研究奠定了基础。 相似文献
17.
重组表达载体pET28a/DAB389(Gly4Ser)2-αMSH在BL21(DE3)中以可溶形式表达重组蛋白,依次通过硫酸铵盐析、离子交换层析、亲和层析纯化、脱盐得93.26%重组蛋白纯品;细胞活性测试结果表明,该重组毒素只对SP2/0、HeLa、A549、A375等4种癌细胞有杀伤作用,对DK、BHK正常细胞没有杀伤力;重组蛋白对SP2/0、HeLa、A549、A375细胞的IC50分别为:3.138、2.736、7.243、4.672 mg/L。 相似文献
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为观察犬新孢子虫可溶性抗原联合Cp G ODN免疫BALB/c小鼠,诱导小鼠的先天性免疫应答,探讨Cp G ODN的佐剂效果。本研究按照每毫升104、105、106、107个虫体制备了犬新孢子虫可溶性抗原,联合Cp G ODN腹腔接种小鼠,注射后1 h、2 h、6 h、12 h收集血清,经ELISA检测IL-6和CCL2水平。结果显示,可溶性抗原联合Cp G ODN产生的IL-6和CCL2约是单抗原组的4~6倍和4~14倍,IL-6集中于免疫注射后2 h产生,而CCL2从免疫后2~12 h一直持续升高,且都具有浓度依赖性。表明犬新孢子虫可溶性抗原联合Cp G ODN可以刺激小鼠产生很强的先天性免疫应答,为进一步研究犬新孢子虫感染宿主的免疫应答机制奠定基础。 相似文献
19.
犬瘟热病毒在不同组织细胞上增殖特性的研究 总被引：2，自引：0，他引：2
将犬瘟热病毒(CDV)分别接种于长满单层的鸡胚成纤维细胞(CEF)、非洲绿猴肾细胞系(Ve-ro)、犬肾细胞系(MDCK),观察其病变时间、病变特征,并对其进行RT-PCR鉴定和TCID50测定。结果表明,CDV在这3种细胞上均能增殖,并产生明显的细胞病变(CPE),但在Vero细胞上产生病变的时间短,病变明显,且TCID50最高;RT-PCR检测CDV在不同细胞上的病毒培养液,均能扩增出337bp的片段;CDV在Vero细胞上的增殖滴度明显高于在CEF、MDCK细胞上的增殖滴度。表明本试验所选用的3种细胞中,Vero细胞最适宜培养CDV,所获得的CDV的毒价最高,病变最明显。 相似文献
20.
《畜牧兽医学报》2016,(8)
旨在探讨牛源犬新孢子虫对孕鼠胎盘激素和细胞因子调节功能的影响。以牛源犬新孢子虫BABL/c孕鼠感染模型为研究对象,同时设置正常对照组孕鼠,在攻虫第12、14、16、18天分批处死孕鼠,采集孕鼠血清,制备孕鼠胎盘细胞悬液,采用ELISA方法对牛源犬新孢子虫感染孕鼠血清中CRH、CG、PRL及E3等胎盘激素水平,以及孕鼠胎盘细胞悬液中IFN-γ、IL-4及TGF-β等细胞因子水平进行检测。结果显示,与正常对照组孕鼠比较,牛源犬新孢子虫感染孕鼠模型随攻虫时间的增加,在孕鼠血清中,CRH水平在第12天时显著升高(P0.05),在第18天时显著下降(P0.01);CG水平在第12天时显著下降(P0.01),在第16天时显著升高(P0.05);PRL水平在第18天时显著下降(P0.05);E3水平在第12天时显著升高(P0.05),第16天时显著下降(P0.05)。在孕鼠胎盘细胞悬液中,IFN-γ水平在第18天时显著升高(P0.05);IL-4水平在第12天时显著升高(P0.05);TGF-β水平在第12天时显著升高(P0.05)。结果表明牛源犬新孢子虫感染导致孕鼠胎盘激素和细胞因子的调节功能失衡,严重影响胎盘血流、胎盘物质转运及胎儿生长发育,将导致不良妊娠的发生。 相似文献