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1.
为建立鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体的间接ELISA检测方法,应用原核表达的IBDV VP2蛋白作为包被抗原,经方阵试验确定间接ELISA试验的最佳反应条件：包被抗原的浓度为8 μg/mL,标准阴、阳性血清的稀释度为1:400,封闭液选用10 %马血清,酶标抗体最佳稀释倍数为1:15000,最佳抗原稀释液为0.01 M PBS(PH 7.2);抗原最佳包被条件为4 ℃过夜,待检血清和酶标二抗反应条件为37 ℃ 60 min,底物作用时间为15 min。待检血清的OD450nm≥0.288判为阳性,反之判为阴性。特异性试验、敏感性试验和重复性试验结果显示,该方法的特异性好、敏感高、重复性好。用建立的间接ELISA方法与商品化IDEXX-ELISA试剂盒对临床血清样品进行检测,符合率为93.5 %。该方法的建立为检测IBDV抗体提供了一种安全、特异、敏感、方便经济的检测方法,为鸡传染性法氏囊病免疫监测和预防控制提供了科学的技术手段。 相似文献
2.
间接ELISA检测抗传染性法氏囊病病毒抗体方法的建立 总被引：1，自引：1，他引：0
采用原核表达的传染性法氏囊病毒(IBDV)核衣壳蛋白VP2作为诊断抗原,建立检测IBD血清抗体的间接ELISA方法.抗原最佳包被量为每孔174.67ng,待检血清最佳稀释度为1:40,待检血清样品的D492nm≥0.43Dpos+0.57Dneg判为阳性,反之判为阴性.对采自安徽省部分地区的979鸡血清样品进行检测,IBDV抗体阳性率为39.73%.结果证实,间接ELISA法用于IBDV血清抗体的监测具有良好的特异性,是一种快速简便的血清学方法,值得在基层推广应用. 相似文献
3.
为建立可检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的间接ELISA检测方法,本研究经RT-PCR扩增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段,并应用pET28a载体进行原核表达,亲和层析纯化重组蛋白作为包被抗原,建立检测IBDV血清抗体的间接ELISA方法。应用所建方法和IDEXX试剂盒,对采自不同地区的156份鸡血清样品进行平行检测和比较。结果表明,RT-PCR扩增获得708bp的VP2基因片段;含重组表达质粒pET28a-VP2的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,表达了约27kDa的VP2重组蛋白,表达量约占菌体蛋白的30.1%;建立的间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒比较,其特异性、敏感性和符合率分别达到90.24%、95.65%和94.23%。由此可见,本研究所建立的间接ELISA方法敏感、特异,适用于IBDV血清抗体的检测。 相似文献
4.
《中国兽医学报》2014,(11):1725-1731
为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。 相似文献
5.
为研制传染性法氏囊病病毒（IBDV）快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得3株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验（IFA）证明,3株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明3株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了试验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102 TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR 3种方法同步检测8种试验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异（P〉0.05）。 相似文献
6.
为研制传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得3株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验(IFA)证明,3株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明3株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了试验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102 TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR 3种方法同步检测8种试验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异(P>0.05)。 相似文献
7.
以鸡传染性法氏囊病超强毒Gx株基因组RNA为模板,通过RT-PCk扩增VP1基因,经EcoRI和和Xho I双酶切处理后与经相同酶切处理的pET-30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及测序鉴定正确的阳性重组子转化BL21(DE3)感受态细胞,融合蛋白His-VP1经IPTG诱导表达后主要以包涵体形式存在.Western blot检测到约97 ku的目的蛋白能够与特异性的VP1单克隆抗体反应.将纯化的目的蛋白免疫新西兰白兔后获得了抗VP1蛋白的血清.该血清能够与重组杆状病毒rBacGxVP1感染的sf9细胞发生特异性反应,而且其ELISA抗体效价达到1:25 600.鸡传染性法氏囊病超强毒VP1基因的表达与兔抗血清的制备为病毒的检测及VP1功能的研究提供了有效工具. 相似文献
8.
《黑龙江畜牧兽医》2020,(14)
为了建立一种检测A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白抗体的阻断ELISA方法,试验用SVA VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘法确定最佳蛋白包被浓度和单克隆抗体最佳稀释倍数。同时对阻断ELISA的其他条件(封闭液、血清稀释度、底物反应条件)进行优化,对方法的特异性和重复性进行考察。结果表明:VP2蛋白最佳包被浓度为0.5μg/mL;最佳封闭液为2%BSA,每孔200μL,37℃封闭1 h;待检血清最佳稀释度为1∶1,在37℃条件下作用1 h;单克隆抗体最佳稀释度为1∶40 000,在37℃条件下作用1 h;底物最佳反应条件为室温避光10 min。特异性试验结果显示,SVA阳性血清与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综征病毒、猪瘟病毒、猪口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本进行荧光抗体中和试验和阻断ELISA方法检测,符合率为96.0%。说明该ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。 相似文献
9.
为了解卵黄抗体与血清抗体间的相关性,分别采集一定数量的莱芜黑鸡、海兰褐蛋种鸡和SPF白来航鸡的血清、鸡蛋,所有鸡蛋与血清样品均一一对应。用禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、呼肠孤病毒(REOV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、AB亚群禽白血病病毒(ALV-AB)、禽传染性贫血病毒(CAV)以及传染性法氏囊病病毒(IBDV)等6种ELISA检测试剂盒,分别检测血清与卵黄中的抗体水平,用SPSSStatistics17.0程序比较分析血清与卵黄抗体OD值的相关系数,从而获得针对ELISA检测卵黄抗体的最佳稀释倍数。结果显示,23~38份卵黄样品中REV、REOV、ALV-J、ALV-AB、CAV以及IBDV的抗体检测最佳稀释比例分别为1∶200、1∶400、1∶250、1∶200、1∶20和1∶500,与血清中抗体OD值的相关系数分别为0.982、0.939、0.927、0.993、0.935和0.989;检测结果还表明,最佳稀释度卵黄与血清样品的阴阳性符合率为96%~100%。本研究显示,卵黄可代替血清样品用ELISA检测试剂盒检测,以判断种鸡群的病原感染状态。 相似文献
10.
为真核表达传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因,将2007年12月从安徽境内发生的传染性法氏囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡法氏囊组织中克隆的IBDV VP2基因插入到pFastBac1供体质粒中,转化E.coilDH10Bac感受态细胞,经抗性筛选,获得重组杆状病毒表达质粒rBac-VP2,用脂质体法转染SD细胞.对rBac-VP2感染的Sf9细胞,用间接免疫荧光试验(IFA)检测,具有特异性荧光;用western blot分析,在50 ku处出现1条特异蛋白条带;电镜观察重组VP2蛋白能够自组装成病毒样颗粒.本实验为研制针对近期流行IBDV的新型病毒样颗粒疫苗和新型检测试剂奠定了基础. 相似文献
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利用纯化的猪细小病毒VP2蛋白为抗原,建立检测猪细小病毒血清抗体的间接VP2-ELISA。最佳反应条件为:抗原包被浓度300 ng/孔,4℃过夜,待检测血清1:50稀释。与猪细小病毒病阳性血清呈阳性反应,与猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪日本脑炎和猪圆环病毒病等5种疾病的阳性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数均小于10%。用该方法与Ceditest PPV猪细小病毒抗体检测试剂盒对102份血清进行平行检测和比较,间接VP2-ELISA的敏感性为93.8%,特异性为81.1%,符合率为89.2%。结果表明,猪细小病毒血清抗体间接VP2-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性,且重复性好,可用于猪细小病毒感染的血清抗体检测。 相似文献
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13.
采用RT-PCR技术从滨州分离株中扩增出传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP4基因,将VP4基因插入到pGEX-4T-1载体上构建pGEX-4T-1-VP4,诱导表达并用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)亲和层析柱纯化得到纯化的重组VP4蛋白。以兔抗鸡IgG为胶体金标记物,以重组IBDV VP4蛋白和羊抗兔IgG为硝酸纤维素膜检测线和质控线的包被物,制备一种能检测IBDV VP4蛋白抗体的胶体金试纸条。结果表明,该试纸条检测IBDV强毒(IBDV BC6/85)免疫的血清检测线显红色,为阳性反应;检测IBDV弱毒(IBDV NB)免疫的血清、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)标准阳性血清、禽流感H5和H9标准阳性血清、传染性支气管炎标准阳性血清及0.85%生理盐水检测线不显红色,为阴性反应。该试纸条与建立的ELISA方法相比,敏感度低2个滴度;检测320份临床血清,试纸条与ELISA的符合率达99.38%。提示,该试纸条使用方便、操作简单,10 min内可以用肉眼判断结果,可为区分IBDV的强弱毒提供参考数据,具有较大的应用价值。 相似文献
14.
通过制备兔抗鸡传染性腔上囊病病毒（IBDV）、小鼠抗IBDV和绵羊抗兔免疫血清,并纯化绵羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,采用方阵滴定法测定其最佳使用浓度,建立了IBDV双夹心ELISA检测方法。结果显示,包被抗体的最适稀释度为1：160,兔抗IBDV的最佳稀释度为1：200,酶标记抗体的最佳稀释度为1：400。特异性和重复性试验结果表明,该方法特异性强,重复性好,与鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡减蛋综合征病毒抗原均不发生交叉反应。对人工感染病例的检测结果表明,建立的双夹心ELISA方法可用于临床快速诊断IBDV。 相似文献
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鸡传染性法氏囊病单抗快速诊断试剂盒的研制及初步应用 总被引：1，自引：0，他引：1
以感染传染性法氏囊病病毒 ( IBDV)的鸡法氏囊组织制备免疫抗原 ,免疫 BALB/c系小鼠 ,取其脾细胞与 NS0浆细胞进行细胞融合 ;以 AC-ELISA筛选阳性细胞克隆 ,经 3次有限稀释克隆化及鉴定 ,获得 2株识别 IBDV不同抗原决定簇的高亲和力单克隆抗体株。以该 2株单克隆抗体制备快速诊断试剂 ,组装了鸡传染性法氏囊病快速诊断试剂盒。该试剂盒由若干 4 0孔酶标板 ,1号酶标液 ( HRP标记 IBDV单抗 )、2号洗涤液、3号显色液 ( TMD显色底物 )、4号显色液 (供氢体 )等反应液 ,0 .0 1 mol/L PBS( p H7.2 )阴性对照、IBDV阳性对照 (提取的 IBDV蛋白 )组成 ,并对试剂盒特异性、敏感性、重复性及稳定性等进行了鉴定。应用该快速诊断试剂盒对来源于不同地区的临床诊断疑似 IBD的法氏囊病料各 2 0份进行了检测 ,并与琼扩试验、常规ELISA检测结果作了比较 ,结果表明 ,该快速诊断试剂盒的检测结果与常规 ELISA的检测结果相似 ,操作程序简便 ,可在 1 0～ 1 5min内完成 ,适合于兽医临床推广应用 相似文献
16.
CpG寡核苷酸对IBDV VP2基因真核表达质粒免疫增效作用 总被引：1，自引：1，他引：1
以传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因表达质粒DNA为免疫原，以CpG的寡核苷酸(CpG-0DN)为免疫佐剂，肌肉注射于14日龄SPF鸡，1周后加强免疫1次，2次免疫后15d和21d分别测定血清ELISA抗体效价，并于免疫后21d用IBDV99儿强毒株攻毒和进行病理学观察。结果显示，(1)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组；(2)IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组，且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高；(3)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率。由此表明，CpG寡核苷酸对IBDV VP2蛋白基因真核表达质粒免疫具有明显增强作用，有很大的应用前景。 相似文献
17.
为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。 相似文献
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兔抗鸡传染性法氏囊病抗体的制备和纯化 总被引：1，自引：0，他引：1
采用自然发病的传染性法氏囊病（IBD）病鸡的法氏囊组织制作鸡IBD油佐剂灭活苗,用鸡IBD油佐剂灭活苗多点皮下注射健康成年兔,获得高免兔抗鸡IBDV血清,经过盐析、透析的方法制备高纯度的兔抗鸡IBDV高免IgG。兔血清中抗体效价为1∶128,蛋白质含量为40.3~48.8 mg/ml;纯化后效价为1∶32,蛋白质含量为18.0~23.0 mg/ml。用此试剂对安徽部分地区疑似鸡IBD的病例进行了诊断,取得良好效果。该试剂为临床琼脂扩散试验(AGP)检测IBDV抗原提供高效价的抗体,并为临床免疫组化法检测IBDV提供可靠的抗体。 相似文献
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《畜牧与兽医》2017,(8):88-92
从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。 相似文献
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为构建表面展示传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的细菌样颗粒(bacterium-like particies, BLPs),试验分别克隆VP2基因和乳酸乳球菌肽聚糖锚钩蛋白(protein anchor, PA)基因片段,通过融合PCR技术构建VP2-PA融合基因,利用Bac-to-Bac杆状病毒/昆虫细胞表达系统构建重组杆状病毒rBV-VP2-PA,将表达产物与裸露BLPs共孵育,在PA的介导下,构建表面展示IBDV VP2蛋白的细菌样颗粒(BLPs-VP2);依次采用透射电镜观察、SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光对BLPs-VP2进行鉴定。结果表明：VP2蛋白获得成功表达并展示于BLPs表面,可与IBDV阳性血清发生特异性结合,1 U(2.5×109颗粒)BLPs最大可负载约107μg VP2-PA融合蛋白。说明构建的IBDV VP2蛋白BLPs可用于传染性法氏囊病(IBD)新型亚单位疫苗的研发。 相似文献