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1.
《中国兽医学报》2020,(3)
利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。 相似文献
2.
堆型艾美耳球虫单链抗体-PE40重组免疫毒素的构建 总被引：1，自引：0，他引：1
用HindⅢ对已构建的质粒pT-PE40和原核表达载体pET22-ScFv进行单酶切,回收纯化1 101 bp的PE40基因片段并将其亚克隆至pET22-ScFv载体中,构建重组免疫毒素表达质粒pET22-ScFv-PE40。将该质粒转化入感受态大肠杆菌J M109中增殖,提取质粒后用SalⅠ和NotⅠ进行双酶切鉴定,得到了1 114 bp和6 181 bp目的基因片段。测序鉴定PE40的插入方向,选取以PE40基因5′端与ScFv基因3′端连接的重组质粒,构建了抗堆型艾美耳球虫重组免疫毒素质粒pET22-ScFv-PE40。抗堆型艾美耳球虫重组质粒pET22-ScFv-PE40经1 mmol/LIPTG诱导,在大肠杆菌中表达约68 000的目的蛋白。使用抗PE多克隆抗体对目的蛋白进行蛋白印迹分析,结果表达产物与抗PE多克隆抗体发生抗原抗体反应,证明融合基因得到表达。 相似文献
3.
猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
《畜牧兽医学报》2003,34(2):195-198
利用PCR技术从猪细小病毒的RF
DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0 kb的基因片段,将PCR产物克隆至pMD18-T载体,利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列.将所得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较,同源性均在99%以上,从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性.将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2;将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8
kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f.利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况,结果发现pET17bVP2f质粒在45
kD处有一特异性表达带,而其它几种质粒均未看到特异性表达带,推测VP2基因3′端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响.这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义. 相似文献
4.
《上海畜牧兽医通讯》2017,(2)
依据Genbank中传染性支气管炎病毒N基因序列,设计引物采用PCR方法从本实验室分离到的病毒株中扩增获得约1 230bp的N基因,并将N基因片段克隆插入pMD18-T载体获得pMD18-T-N;采用酶切(Eco RI、XhoI)的方法从已构建的T克隆质粒pMD18-T-N上获得IBVN基因片段,将其亚克隆插入原核表达载体pET32a,成功构建重组原核表达质粒pET32a-N。将重组质粒转入BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/mL的IPTG在37℃进行诱导,5h后表达量最高。这一原核表达载体pET32a-N的构建为进一步研究核酸疫苗奠定了前期基础。 相似文献
5.
为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌(Hp)铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。 相似文献
6.
为原核表达鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)NS1重组蛋白,本研究通过RT-PCR方法扩增NS1基因,将其亚克隆至pET32a(+)载体中构建重组表达质粒pET32a-NS1。将其转化大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导表达了约59 ku的重组蛋白。Western blot分析表明,该重组蛋白可以与DTMUV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。 相似文献
7.
为获得高活性的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）VP2蛋白的重组蛋白,本试验对IBDV VP2蛋白基因与能进行自我组装的幽门螺杆菌（Hp）铁蛋白基因进行融合PCR扩增,获得其融合基因。根据成熟VP2蛋白基因cDNA序列和Hp铁蛋白基因的碱基序列,设计合成2对引物,应用融合PCR技术扩增获得融合基因片段VP2-Fe。将目的基因克隆至pMD18-T载体筛选阳性重组克隆质粒,然后将目的基因亚克隆至真核表达载体pPICZaC后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选获得阳性表达质粒。结果显示,通过两轮PCR扩增出长度为1 824 bp的融合基因VP2-Fe,亚克隆至pMD18-T载体,测序结果显示,融合基因无任何碱基的突变,筛选的阳性质粒命名为pMD-VP2-Fe。双酶切回收目的基因大小为1 824 bp,亚克隆至pPICZaC,PCR和双酶切鉴定出现预期大小的片段,将获得的阳性表达质粒命名为pPICZaC-VP2-Fe。本研究为后期利用真核表达载体获得其融合重组蛋白奠定基础。 相似文献
8.
牛传染性鼻气管炎病毒糖蛋白gC基因抗原活性区的克隆与表达 总被引：1，自引：0，他引：1
通过聚合酶链式反应从牛传染性鼻气管炎病毒Bartha Nu/67株中扩增得到病毒gC基因并克隆至T载体pMD20T,再以后者为模板扩增gC蛋白第15~177位氨基酸对应的抗原活性区片段gCd。将gCd插入原核表达载体pET32a构建重组表达质粒pET32a-bhv1gCd。限制性内切酶以及序列分析鉴定表明重组表达质粒克隆片段序列与阅读框正确。对重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)的培养物进行蛋白电泳,可检测到分子量约45ku的目的产物,IPTG诱导后5h表达量最高。免疫印迹试验结果证实,gCd重组蛋白与牛传染性鼻气管炎标准阳性血清发生特异性反应,表明gC抗原活性区片段在原核获得表达并具有良好的抗原性。该重组蛋白可用于建立ELISA等免疫诊断方法。 相似文献
9.
【目的】原核截短表达猪细小病毒6型(Porcine parvovirus type 6,PPV6)ORF2基因,并制备PPV6 VP1((348 aa-675 aa))蛋白多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】以PPV6分离毒株基因组为模板,PCR扩增获得ORF2截短基因片段,将其克隆至原核表达载体pET30a(+)中构建重组质粒pET30a-PPV6-ORF2。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定纯化后重组蛋白。将纯化后的重组蛋白与弗氏佐剂混匀乳化,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体,采用Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和间接ELISA鉴定免疫兔血清特异性。【结果】成功构建了pET30a-PPV6-ORF2重组表达载体,原核截短表达了PPV6 VP1((348 aa-675 aa))蛋白;SDS-PAGE结果显示,重组PPV6 VP1( 相似文献
10.
参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。 相似文献
11.
根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础. 相似文献
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为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。 相似文献
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禽呼肠孤病毒σC基因的克隆和表达 总被引：1，自引：0，他引：1
采用RT-PCR技术设计扩增禽呼肠孤病毒(ARV)S1133毒株的σC基因,将扩增基因克隆至pMD-19T载体上,经PCR、酶切及测序鉴定,克隆的基因片段为ARV σC基因.将该基因重组至pET32a(+)原核表达载体上成功构建了表达裁体pET32a-σC.该重组质粒在大肠杆菌BL21中经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h得到最佳表达.表达重组蛋白的相对分子质量为54 000,以包涵体形式存在.经Western-blot分析表明,该重组蛋白能于ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的反应原性. 相似文献
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猪细小病毒VP2基因的克隆、测序与原核表达 总被引：9，自引：0，他引：9
利用PCR技术从猪细小病毒的RF DNA模板中扩增了含有VP2全基因的2.0kb的基因片段，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，利用双脱氧末端终止法测定了VP2全基因的核苷酸序列。将所得的核心苷酸序列和推导的氨基酸序列分别与GenBank中的相应序列进行同源性比较，同源性均在99%以上，从而说明该蛋白的碱基序列和氨基酸序列均具有高度的保守性。将VP2全基因分别克隆入原核表达载体pET15(b)、pET17(b)和pET28(b)构建成表达质粒pET15bVP2、pET17bVP2和pET28bVP2；将含有VP2基因起始位点至EcoRⅠ切点间的0.8kb片段克隆入pET17(b)中构建成表达质粒pET17bVP2f。利用上述四种质粒转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导后SDS-PAGE检测表达情况，结果发现pET17bVP2f质粒在45kD处有一特异性表达带，而其它几种质粒均未看到特异性表达带，推测VP2基因3‘端的某些结构可能对VP2全基因的表达有一定影响。这一结果对研究VP2基因的结构与功能具有重要意义。 相似文献
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将从组织病料中提取的鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)核酸进行PCR扩增,获得vp1基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了CIAV vp1基因重组质粒,命名为pET32a-vp1。将 pET32a-vp1转化E.coli plys,重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果表明,vp1基因在大肠杆菌中成功表达。纯化的蛋白质作为包被抗原,ELISA鉴定结果表明具有良好的抗原性。本试验结果为进一步研究用重组抗原制备CIAV ELISA诊断试剂盒奠定了基础。 相似文献
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将猪β-防御素-2基因(pBD-2)片段正确连接到pET32a载体上,从而得到稳定表达pBD-2的大肠杆菌表达株。根据已报道的pBD-2基因序列,按大肠杆菌密码子优化原则合成了5条pBD-2基因片段,通过重叠延伸PCR(SOE PCR)方法将这5段延伸成完整的pBD-2基因序列,将该基因定向插入原核表达质粒pET32a的多克隆位点上,成功地在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出TrxA-pBD2融合蛋白。结果显示,表达的融合蛋白用肠激酶切掉TrxA后做琼脂孔穴扩散法检测,pBD-2对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性,表明试验获得表达pBD-2的大肠杆菌菌株。 相似文献
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克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。 相似文献