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1.
研究布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7后类泛素SUMO-1的表达变化,并构建小鼠类泛素SUMO-1基因过表达的慢病毒载体。本试验分别利用布鲁氏菌16M、M5-90侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测细胞中类泛素SUMO-1的表达;利用DNA重组技术将类泛素SUMO-1基因片段插入到慢病毒表达载体pLEX-MCS 中,获得重组慢病毒质粒pLEX-SUMO-1,测序鉴定成功后转染293T 细胞,包装好的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,并利用实时荧光定量PCR、Western blotting方法分别检测细胞中类泛素SUMO-1 mRNA及蛋白表达水平。结果表明,布鲁氏菌16M、M5-90侵染细胞后,在感染早期类泛素SUMO-1的表达受到抑制,12 h内呈现下降趋势,在12 h后开始上升,极显著高于正常水平(P < 0.01);测序结果证明,类泛素SUMO-1基因正确插入到pLEX-MCS 质粒中;实时荧光定量PCR方法检测表明,类泛素SUMO-1 mRNA转录水平上调。由此可见,布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7能够引起细胞内类泛素SUMO-1表达的改变;成功构建了类泛素SUMO-1慢病毒过表达载体,为进一步研究类泛素SUMO-1的功能奠定基础。 相似文献
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为探究泛素相关修饰蛋白SUMO-2对布鲁氏菌16M的影响，本试验构建了SUMO-2基因干扰和过表达小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，并用布鲁氏菌16M进行侵染。参照GenBank中SUMO-2基因序列设计特异性干扰片段和过表达引物，克隆成功后连接至相应的慢病毒载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取阳性克隆菌提取质粒转染HEK-293FT细胞，将重组的慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用布鲁氏菌16M分别侵染构建成功的干扰和过表达细胞模型。通过实时荧光定量PCR检测SUMO-2 mRNA的转录水平，Western blotting检测SUMO-2蛋白的表达，ELISA检测IFN-γ和TNF-α水平，菌落计数来确定布鲁氏菌在细胞中的存活能力。结果显示，与对照组相比，干扰组SUMO-2 mRNA水平极显著降低（P<0.01），过表达组SUMO-2 mRNA水平极显著升高（P<0.01），成功构建了SUMO-2干扰和过表达细胞模型。Western blotting结果显示，布鲁氏菌16M感染能以时间依赖的方式下调SUMO-2蛋白的表达。经菌落计数后发现，SUMO-2过表达后布鲁氏菌的数量极显著减少（P<0.01），抑制布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。而SUMO-2干扰后布鲁氏菌的数量显著或极显著增加（P<0.05；P<0.01），促进布鲁氏菌16M的细胞内繁殖。同时，经SUMO-2过表达后，IFN-γ和TNF-α水平极显著升高（P<0.01）。经SUMO-2干扰后，TNF-α水平显著降低（P<0.05），IFN-γ水平极显著降低（P<0.01），SUMO-2在RAW264.7细胞中的表达变化也影响IFN-γ和TNF-α的产生。综上所述，SUMO-2蛋白在布鲁氏菌胞内存活中起着重要作用，可能有助于阐明布鲁氏菌感染的致病机制。 相似文献
3.
【目的】构建布鲁氏菌BPE159基因缺失株,研究缺失株体外生长变化特征及其在宿主细胞中的存活能力,探究布鲁氏菌感染期间分泌蛋白BPE159对自噬因子表达的影响。【方法】同源重组方法构建布鲁氏菌BPE159基因重组质粒,电转化布鲁氏菌S2308感受态细胞构建BPE159基因缺失株S2308ΔBPE159。PCR扩增BPE159基因,连接转化构建pBBR1MCS-4-BPE159载体,提取质粒进行电转化,构建BPE159基因回补株S2308ΔBPE159-C。琼脂糖凝胶电泳检测缺失株和回补株遗传稳定性。构建布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,实时荧光定量PCR检测布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子ATG5、Beclin1、LC3a和LC3b基因表达水平。以S2308、S2308ΔBPE159和S2308ΔBPE159-C株侵染小鼠巨噬细胞,收集细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测BPE159基因缺失对布鲁氏菌侵染后自噬细胞因子表达水平的影响。在相同起始浓度下培养S2308、S2308ΔBPE159及S2308ΔBPE159-C株,观察细菌生长变化趋势;评价S2308ΔBPE159株在不同... 相似文献
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试验旨在分析糖基转移酶编码基因WadC影响布鲁氏菌胞内存活的作用。以羊种布鲁氏菌Rev.1基因组为模板,通过同源重组方法获得WadC基因上、下游同源臂融合片段,并与载体pUC19-SacB连接,构建pUC19-SacB-ΔwadC重组载体,电转至羊种布鲁氏菌Rev.1,构建ΔwadC缺失株（Rev.1ΔwadC）,检测菌株Rev.1ΔwadC的遗传稳定性,比较分析亲本株Rev.1和缺失株Rev.1ΔwadC的生长特性及其在BMDC和RAW264.7细胞中的生存能力。结果显示,试验成功构建基因缺失株,连续传代30次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株Rev.1ΔwadC与亲本株Rev.1生长趋势相似,均在20 h到达对数生长期,44 h进入平台期;侵染BMDC细胞48和72 h时,其胞内存活率显著低于亲本株（P<0.05）;而侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞试验显示,亲本菌株和基因缺失株无显著性差异（P>0.05）。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌WadC基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在BMDC细胞内的存活能力显著变弱,为深入研究布鲁氏菌WadC基因功能奠定基础。 相似文献
6.
The purpose of the test was to analyze the role of the glycosyltransferase-encoding gene WadC in affecting the intracellular survival of Brucella.Using the Brucella sheep Rev.1 genome as template,the fusion fragments of the homologous arms of the upper and lower arms of WadC gene were obtained by homologous recombination,and ligated to the vector pUC19-SacB to construct the pUC19-SacB-ΔwadC recombinant vector,which was transferred to sheep species Brucella Rev.1,constructing a ΔwadC deletion strain (Rev.1ΔwadC),testing the genetic stability of the strain Rev.1ΔwadC,comparing and analyzing the growth characteristics of the parental strain Rev.1 and the deletion strain Rev.1ΔwadC and the BMDC and RAW264.7 viability of cells.The results showed that the gene-deficient strain was successfully constructed in the experiment,and no genetic back mutation was found in 30 consecutive passages.Under the same culture conditions in vitro,the growth trend of the deleted strain Rev.1ΔwadC was similar to that of the parental strain Rev.1,and both reached logarithmic growth period at 20 h and reached plateau period at 44 h.When the BMDC cells were infected at 48 and 72 h,the intracellular survival rate was significantly lower than that of the parent strain (P<0.05).The RAW264.7 macrophage test of infected mice showed that the parent strain had no significant difference with the gene deletion strain (P>0.05).To sum up,this experiment successfully constructed and obtained a strain of Brucella WadC gene with good genetic stability.The deletion strain had similar growth trend with the parent strain under in vitro culture conditions;However,the survival ability of the deletion strain in BMDC cells was significantly weakened.This study laid a foundation for further study on the function of WadC gene of Brucella. 相似文献
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本试验用布鲁氏菌强、弱毒株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,旨在探讨NF-κB信号通路与布鲁氏菌强、弱毒株在胞内生存的关系。采用光滑型牛布鲁氏菌2308、粗糙型牛布鲁氏菌RB51在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,侵染0、4、8、24 h后,裂解细胞收集蛋白,Western blotting检测布鲁氏菌对激活NF-κB信号通路的影响。利用不同浓度的NF-κB信号通路抑制剂处理小鼠巨噬细胞RAW264.7,然后用布鲁氏菌在不同感染复数下侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,ELISA试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达量;同时对胞内菌CFU进行计数。结果显示粗糙型牛布鲁氏菌RB51可以强烈激活NF-κB信号通路,光滑型牛布鲁氏菌2308对其激活作用较弱;同时对NF-κB信号通路的激活具有浓度依赖性,在感染复数为80:1、侵染时间为8 h时光滑型牛布鲁氏菌2308和粗糙型牛布鲁氏菌RB51对NF-κB激活程度最强,且该通路参与产生TNF-α、IL-1β和IL-6;NF-κB信号通路抑制剂BAY11-7082影响布鲁氏菌在胞内的生存。因此,粗糙型牛布鲁氏菌RB51胞内存活与NF-κB信号通路密切相关,为进一步研究布鲁氏菌的胞内致病机制奠定基础,也为布鲁氏菌新型药物的研发、家畜布鲁氏菌病预防和治疗提供科学依据。 相似文献
8.
By the infection of Brucella virulent strain and attenuated strain in mice macrophage RAW264.7,the assay was aimed to explore the relationship between NF-κB signaling pathways and Brucella virulent strain and attenuated strain in intracellular survival.Use different MOI Brucella (2308,RB51,16M and M5) to infect mice macrophage RAW264.7,after 0,4,8 and 24 h infected,cracking cell and collecting supernatant,we detected the effect of Brucella on activation of NF-κB signaling pathway by Western blotting.Different concentrations of NF-κB signaling pathway inhibitor were incubated with mice macrophage RAW264.7,with different multiplicities of infection (MOI) of Brucella infecting cells,ELISA kits to detect the expressions of TNF-α,IL-1β and IL-6 cytokine;At the same time,count the number of intracellular bacteria of CFU.The results showed that rough cattle Brucella strains RB51 could strongly activate NF-κB signaling pathway,smooth cattle Brucella strains 2308 was weak in the activation;At the same time,the activation of NF-κB signaling pathway was concentration dependent.When the MOI was 80,infection time was 8 h,NF-κB activation degrees of rough cattle Brucella strains RB51 and smooth cattle Brucella strains 2308 were the strongest,and this pathway was involved in producing TNF-α and IL-6;NF-κB signaling pathway inhibitor BAY11-7082 affected Brucella intracellular survival.So rough cattle Brucella strains RB51 intracellular survival and NF-κB signaling pathway activity were closely related.The results laid the foundation for the further study of Brucella intracellular pathogenesis,also provided scientific basis for the research of new drugs to Brucella,and prevention and treatment of brucellosis. 相似文献
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【目的】 探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞（RAW264.7）自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】 首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物（miR-145a-3p mimics）和抑制剂（miR-145a-3p inhibitor）及对照模拟物（NC mimics）,转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因（autophagy-related gene 14,ATG14）的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】 miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低（P<0.01）。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低（P<0.01）、ATG14蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）,miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调（P<0.01）;布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高（P<0.01）,且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组（P<0.05）。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低（P<0.05）。【结论】 miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。 相似文献
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为了探讨E3泛素连接酶Nrdp1、SOCS-1基因在布鲁氏菌侵染巨噬细胞过程中对细胞凋亡的影响,构建Nrdp1、SOCS-1基因的干扰和过表达细胞模型(简称为pLL3.7-N1、pLL3.7-S1和pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1);羊种布鲁氏菌16M(简称16M) 侵染正常细胞RAW264.7及pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEX-SOCS-1组细胞,qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、TNF-α的mRNA表达量,并通过流式细胞仪术检测细胞凋亡率。结果显示,试验成功构建并筛选出干扰和过表达Nrdp1、SOCS-1效果最好的pLL3.7-N1、pLEX-Nrdp1、pLL3.7-S1、pLEX-SOCS-1细胞模型;16M侵染各组细胞,与对照组相比,在不同的时间段pLL3.7-N1、pLL3.7-S1、pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞的Bcl-2和Bax的mRNA表达量差异显著(P < 0.05);pLL3.7-S1组细胞的TNF-α mRNA显著降低(P < 0.05),而pLEX-SOCS-1组显著升高(P < 0.05);pLEX-Nrdp1、pLEX-SOCS-1组细胞凋亡率显著升高(P < 0.05),而pLL3.7-S1组显著降低(P < 0.05)。研究结果表明,Nrdp1、SOCS-1基因与16M诱导的细胞凋亡密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。 相似文献
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JIANG Ya-li CHEN Chuang-fu CHE Zhao-tang WANG Zhen LI Shuang ZHANG Huan ZHANG Hui GUO Fei 《中国畜牧兽医》2016,43(6):1393-1404
In order to investigate the effect of E3 ubiquitin ligase Nrdp1 and SOCS-1 genes on apoptosis during Brucella infection macrophages.The cell models of interference and over expression of Nrdp1 and SOCS-1 genes (pLL3.7-N1,pLL3.7-S1 and pLEX-Nrdp1,pLEX-SOCS-1) were constructed.Normal RAW264.7 cell,pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1 and pLEX-SOCS-1 group cells were infected with Brucella melitensis 16M (referred to 16M),the expression of Bax,Bcl-2,TNF-α genes were detected by qRT-PCR and apoptosis rate was detected by flow cytometry.pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1,pLEX-SOCS-1 cell model of the works best of interference and overexpression Nrdp1,SOCS-1 were successfully constructed and screened.After 16M infecting each group cells,compared with the control group,the expression of Bcl-2 and Bax mRNA in pLL3.7-N1,pLEX-Nrdp1,pLL3.7-S1 and pLEX-SOCS-1 groups were significantly different in different time periods (P < 0.05).The expression of TNF-α mRNA in pLL3.7-S1 group was significantly lower (P < 0.05),while the pLEX-SOCS-1 group was significantly higher (P < 0.05).Apoptosis rates in pLEX-Nrdp1,pLEX-SOCS-1 groups were significantly higher (P < 0.05),while pLL3.7-S1 group was lower (P < 0.05).The results showed that the Nrdp1 and SOCS-1 genes were closely related to apoptosis with 16M induction,the research laid the foundation for the study of 16M intracellular parasitism mechanisms. 相似文献
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【目的】 试验旨在构建牛种布鲁氏菌S2308的多铜氧化酶(BMCO)基因缺失株,探究缺失株的生长特性及在宿主细胞中的存活能力,并分析BMCO蛋白的结构。【方法】 利用PCR扩增BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因,通过融合PCR技术将3段基因进行融合。融合片段与pMD19-T载体连接,制作牛布鲁氏菌S2308感受态细胞,1 800 V电压、400 Ω电阻电转化至牛种布鲁氏菌S2308感受态细胞中,涂布于Kan抗性的布鲁氏菌固体培养基中,筛选挑取阳性菌落,连续培养10代,检测第10代阳性菌落的遗传稳定性和生长变化趋势,将pBBR1MCS-4-BMCO融合质粒电转至能够稳定遗传BMCO基因缺失的牛种布鲁氏菌中,培养筛选阳性菌落。以感染复数(MOI)100分别用亲本株、缺失株、回补株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过平板计数法分别检测3种菌株在细胞内的生存能力。【结果】 试验成功获得片段大小为522、539、1 054 bp的BMCO基因上、下游同源臂和Kan基因;成功构建pMD19-T-BMCO-Kan融合片段重组载体;获得稳定遗传的BMCO基因缺失株,命名为S2308ΔBMCO;成功构建BMCO基因回补株,命名为ΔBMCO::BMCOS2308;缺失株和亲本株表现的生长曲线相同,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染小鼠巨噬细胞RWA264.7后,与亲本株S2308相比,S2308ΔBMCO株在胞内的生存能力极显著降低(P<0.01)。生物信息学分析结果表明,BMCO属于疏水蛋白,定位于胞质且含有大量的无规则卷曲、α-螺旋和延伸链,预示该蛋白具有多个结合位点。【结论】 本研究成功构建了布鲁氏菌BMCO基因的缺失株和回补株,BMCO基因的缺失不影响其生长性能,但其在宿主细胞内的存活能力显著性降低,初步分析了BMCO蛋白的结构,为后续布鲁氏菌分泌蛋白的功能研究奠定基础。 相似文献
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试验旨在研究结核分枝杆菌Rv2626c蛋白对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡的影响。根据GenBank数据库中结核分枝杆菌Rv2626c基因序列设计引物,并以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv cDNA为模板,PCR扩增Rv2626c基因并克隆至慢病毒表达载体pLEX-EGFP中,包装慢病毒并感染RAW264.7细胞,使用Western blotting和流式细胞仪技术检测Rv2626c蛋白表达水平和RAW264.7细胞凋亡率变化。结果显示,成功构建慢病毒表达载体pLEX-EGFP-Rv2626c;成功包装慢病毒并感染RAW264.7细胞;Rv2626c蛋白在RAW264.7细胞中高水平表达显著促进了细胞凋亡。本试验结果表明,在RAW264.7细胞中过表达结核分枝杆菌Rv2626c蛋白能显著性增加其凋亡水平。 相似文献
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旨在研究布鲁氏菌外膜蛋白OMP16对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡和免疫活性的影响及其机制探讨。以OMP16处理RAW264.7细胞为模型,通过MTT以及Hoechst法检测OMP16对细胞活力的影响,通过Western blot检测Caspase-3、GRP78、CHOP的表达情况,流式细胞术检测OMP16对细胞凋亡的影响以及RT-PCR检测免疫因子IL-1β、IL-6和TNF-α的变化。结果表明,OMP16能够影响RAW264.7细胞的活力,且有浓度依赖性;添加OMP16后能够显著增加凋亡标志因子Caspase-3的表达（P<0.001）,并促进RAW264.7细胞的凋亡;作用24、36 h之后,显著引起内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达;并且能显著上调IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的mRNA表达水平。布鲁氏菌OMP16能够诱导RAW264.7凋亡,OMP16显著引起内质网应激CHOP通路的激活。 相似文献
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为深入研究Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family，member A，Rhoa）和环氧合酶2（cyclooxygenase 2，Ptgs2）分子在布鲁菌逃逸机体免疫中发挥的作用，试验对RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因进行扩增与克隆，构建真核表达载体并预测生物信息学功能。根据GenBank数据库中公布的RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因CDS区序列（登录号：JN971019.1和NM_011198）设计引物，提取RAW264.7细胞总RNA并反转录为cDNA，经RT-PCR扩增Rhoa和Ptgs2片段并测序，将纯化的Rhoa和Ptgs2片段分别与线性化pcDNA3.1质粒相连接，对重组质粒进行测序分析和双酶切鉴定后，利用LipofectamineTM 2000转染293T细胞，经实时荧光定量PCR和Western blotting验证Rhoa和Ptgs2基因的表达情况，并应用生物信息学软件对Rhoa和Ptgs2基因进行预测分析。结果显示，试验成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达质粒；实时荧光定量PCR检测均在转录水平上表达；Western blotting可见Ptgs2蛋白在70 ku处有一明显条带，而Rhoa蛋白未出现条带。生物信息学预测显示，Rhoa和Ptgs2基因核苷酸序列相似性较高，在不同物种之间较为保守；Rhoa不具有信号肽，为不稳定蛋白，而Ptgs2在第17-18位氨基酸处存在信号肽，为稳定蛋白；Rhoa和Ptgs2蛋白分别有12和53个潜在的磷酸化位点；二级结构、三级结构均以无规则卷曲为主。本研究成功构建了RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因的真核表达载体，均在转录水平上表达，并分析了其生物学功能，为后续开展RAW264.7细胞Rhoa和Ptgs2基因在布鲁菌免疫机制方面的研究提供了工具。 相似文献
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[目的] 试验旨在探究线粒体融合蛋白2（MFN2）基因干扰与过表达对布鲁氏菌诱导小鼠巨噬细胞凋亡的影响。[方法] 利用RNA干扰技术设计3条特异性针对MFN2基因的siRNA序列（siMFN2-450、siMFN2-1661、siMFN2-2275）和1条阴性干扰序列（siMFN2-Negative）;利用空质粒pcDNA3.1-EGFP通过过表达技术构建1个重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2。双酶切法鉴定过表达重组质粒pcDNA3.1-EGFP-MFN2,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测筛选最佳干扰序列并鉴定重组质粒的过表达效率,使用筛选出的最佳干扰序列和鉴定过表达后的重组质粒分别构建MFN2基因干扰及过表达的转染巨噬细胞模型;用牛种布鲁氏菌疫苗株A19侵染巨噬细胞,按照细菌数：细胞个数=100：1的比例侵染24 h,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）相关X蛋白（BAX）的表达情况,用流式细胞术检测细胞凋亡情况。[结果] 双酶切结果显示,pcDNA3.1-EGFP-MFN2过表达重组质粒构建成功;实时荧光定量PCR和Western blotting结果显示,siMFN2-1661组MFN2的表达极显著降低（P<0.01）,pcDNA3.1-EGFP-MFN2组MFN2的表达极显著增加（P<0.01）,成功构建干扰及过表达MFN2基因的转染巨噬细胞模型;布鲁氏菌侵染干扰MFN2基因表达的巨噬细胞后,BAX蛋白表达水平显著高于siMFN2-Negative组（P<0.05）,BAX转录水平和细胞凋亡率极显著高于siMFN2-Negative组（P<0.01）;布鲁氏菌侵染过表达MFN2基因的巨噬细胞后,BAX的转录及蛋白表达水平均显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.05）,细胞凋亡率极显著低于pcDNA3.1-EGFP组（P<0.01）。[结论] 本试验结果表明,干扰MFN2基因的表达会增强布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,而过表达MFN2基因则会抑制布鲁氏菌诱导细胞凋亡的能力,结果可为研究MFN2基因的生物学功能提供参考,为进一步解析布鲁氏菌的致病机制提供理论基础。 相似文献
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为研究铁调控因子irr和rirA在羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）感染过程中的作用,本研究通过卡那替换的方法构建两个缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA,分别将亲本株和缺失株在相同营养条件下培养36 h,观察其振荡培养时的生长变化趋势。分别将1×108 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90接种到含1.5 mol/L NaCl、pH 2.5、pH 11.5、10 mmol/L H2O2的1 mL布鲁氏菌液体培养基,比较缺失株和亲本株在不同条件下的生长特性;分别以1×106 CFU M5-90Δirr、M5-90ΔrirA和M5-90感染小鼠巨噬细胞RAW264.7检测缺失株的黏附、侵袭和胞内生存能力。结果显示,在相同体外培养条件下缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA生长速度明显低于亲本株;M5-90Δirr、M5-90ΔrirA在高盐、强酸和强碱环境下生存率均显著或极显著低于亲本株（P<0.05;P<0.01）,在H2O2条件下这两个缺失株的生存率却显著高于亲本株（P<0.05）。与亲本株相比,缺失株在小鼠巨噬细胞RAW264.7内的侵袭和黏附能力均减弱,在感染后45 min缺失株M5-90Δirr和M5-90ΔrirA的黏附和侵袭能力均极显著低于亲本株（P<0.01）,但在感染后24 h,这两个缺失株在细胞内繁殖能力与亲本株相比有所增强。本研究报道了irr和rirA基因不仅调控了羊种布鲁氏菌的生长,同时对细菌黏附和侵袭能力也产生一定的影响,M5-90Δirr和M5-90ΔrirA是两株具有潜力的布鲁氏菌候选疫苗株。 相似文献
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为建立检测血清中布鲁氏菌抗体的间接ELISA方法,本试验采用PCR技术从羊种布鲁氏菌QY1菌株中扩增得到wzt基因片段,连接到pET-30a载体上,构建质粒pET-30a-wzt,将鉴定正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞,经原核表达系统对其进行表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析后,用亲和层析镍柱纯化wzt重组蛋白备用。以wzt重组蛋白为检测抗原,逐步优化条件后建立布鲁氏菌间接ELISA检测方法。结果显示,试验成功构建了pET-30a-wzt原核表达载体,并在BL21（DE3）宿主菌中表达;SDS-PAGE和Western blotting结果表明,重组蛋白约为35 ku,表达形式为上清,条带单一、无杂带,有很好的反应原性和特异性。ELISA优化试验确定了最佳包被浓度为15 μg/mL,血清最佳稀释度为1：80,酶标抗体的最佳稀释度为1：5 000;通过检测24份阴性样品确定临界值,当样品D450 nm值≥ 0.30为阳性,样品D450 nm值<0.30时为阴性;特异性试验表明,该方法不与小肠耶尔森菌、大肠杆菌发生交叉反应;批内及批间变异系数均<10%;用该方法对120份血清样本进行检测,并与虎红凝集试验进行相符性验证,符合率为96%。本试验建立的间接ELISA方法为布鲁氏菌病的检测提供了可靠的技术手段。 相似文献
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为进行布鲁氏菌介导的mmu-miR-671-5p的靶基因预测,本试验利用布鲁氏菌（Brucella）感染RAW264.7细胞后,分别运用miRanda和TargetScan软件进行差异表达的mmu-miR-671-5p靶基因的预测,预测的靶基因分别有11 953和9 252个,将预测结果取交集进行韦恩（Venn）分析,重叠部分的靶基因有3 681个;利用GO与KEGG进行功能富集性分析,再利用PicTar软件进一步对mmu-miR-671-5p的靶基因进行预测,将预测结果与Venn分析结果进一步取交集,结果显示,mmu-miR-671-5p的预测靶基因有7个;实时荧光定量PCR分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因相对表达量极显著降低（P<0.01）;在RAW264.7细胞中转染mmu-miR-671-5p inhibitors,分别验证7个预测靶基因的相对表达量发现,Tnfrsf1b与Tnip1基因的相对表达量极显著升高（P<0.01）;对mmu-miR-671-5p与Tnfrsf1b和Tnip1的3'非翻译区（3'UTR）结合靶位点分别进行预测,结果初步表明,mmu-miR-671-5p的靶基因为Tnfrsf1b与Tnip1,其预测结合靶位点均只有1个,分别位于Tnfrsf1b和Tnip1 3'UTR全长位置的91和305 bp。本研究结果为进一步揭示mmu-miR-671-5p在布鲁氏菌感染RAW264.7细胞过程中的功能提供科学依据。 相似文献
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本研究旨在调查活性氧过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）对猪卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）过程中蛋白质类泛素SUMO-1表达及精-卵结合能力的影响。试验分为0（control）、10、50、75和100 μg/mL H2O2处理组。利用Western blotting、流式细胞术、实时荧光定量PCR、Hoechst染色等方法检测猪卵母细胞体外成熟、蛋白质类泛素SUMO-1含量、细胞活力、凋亡基因mRNA表达、透明带（zona pellucid,ZP）溶解度和精子-卵母细胞结合的表达。结果表明,75 μg/mL H2O2组与对照组、10和50 μg/mL H2O2组比较卵母细胞体外成熟率及细胞活力显著降低;75 μg/mL H2O2组与其他H2O2组相比ZP溶解时间显著延长,并减少了精子黏附在成熟卵母细胞透明带上的数量（P<0.05）。在77和18 ku处出现SUMO-1蛋白标记,75 μg/mL H2O2组与对照组、10和50 μg/mL H2O2组比较SUMO-1蛋白含量显著降低（P<0.05）。75 μg/mL H2O2与对照组、10和50 μg/mL H2O2组比较显著下调了Bcl-2基因,而Caspase-3基因表达与对照组和10 μg/mL H2O2组比较显著升高（P<0.05）,50 μg/mL H2O2与对照组和10 μg/mL H2O2组相比显著上调了Bax基因水平（P<0.05）。综上所述,H2O2能调控猪卵母细胞体外成熟过程中类泛素化水平以及精-卵结合能力。 相似文献