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1.
《（《农业科学与技术》）编辑部》2008,(1)
RT-PCR作为一种现代分子生物学基因诊断技术,具有高度敏感性和特异性,能在数小时内检出痕量病原,可克服传统的禽流感病毒(AIV)诊断技术病毒分离鉴定试验周期长的缺点,为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。引物设计是保证RT-PCR成功的重要前提。笔者对运用Primer Pr 相似文献
2.
利用多重反转录聚合酶链式反应同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒.在GenBank中搜索H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,并利用DNAStar软件分析其相似性,利用Primer Premier 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物.这3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228和830 bp.结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228和830 bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应.该多重RT-PCR对H5、H7和H9哑型AIV cDNA的最低检出量分别为10 Pg、1 ng和10 Pg. 相似文献
3.
《安徽农业科学》2020,(5):96-99
[目的]建立可同时鉴别检测H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的二重RT-PCR检测方法。[方法]根据GenBank中H9和H10亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物之间的浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。[结果]特异性试验结果表明,该方法可以特异性扩增出H9和H10亚型AIV对应大小的目的条带,而对其余亚型禽流感病毒及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。同时,该检测方法对H9和H10亚型AIV的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。临床样品的检测结果表明其与病毒分离结果相一致(100%)。[结论]该研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可在一管内同时鉴别检测H9与H10两种亚型AIV,为H9与H10亚型AIV的监测提供了技术支撑。 相似文献
4.
《江苏农业科学》2016,(6)
H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)是危害我国养禽业的主要病毒之一,造成了严重的经济损失。根据H9亚型AIV的HA基因设计了1对引物,建立了H9亚型禽流感病毒的RT-PCR鉴定方法。H9亚型AIV的HA基因预期扩增的目的片断长度为425 bp。对H9N2亚型禽流感病毒不同稀释度的尿囊液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10~(4.25)EID_(50)/100μL。建立的RT-PCR检测方法对H9、H3、H4、H5亚型AIV及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等进行检测,结果仅有H9N2亚型AIV出现特异性目的条带,其他均未出现目的条带,与其他常见禽病病原无交叉反应;用建立的RT-PCR和病毒分离2种方法同时对10株H9N2亚型AIV和8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品进行检测,结果 2种检测方法的符合率达100%。说明该鉴定方法特异性强,敏感性较高。 相似文献
5.
【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein/MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50 min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIV RT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。 相似文献
6.
【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein／MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIVRT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。 相似文献
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8.
为H9与H6亚型禽流感病毒(AIV)的监测及其防控提供技术支撑,依据Genbank中H9和H6亚型AIV的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立并优化可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的三重RT-PCR检测方法,并对所建方法进行特异性、敏感性及临床样品检测验证。结果表明:三重RT-PCR反应的最佳体系为2×PCR Mix 12.5μL,H9与H6亚型AIV cDNA共2μL为模板,特异性引物M-F和M-R(20pmol/μL)加入量为0.6μL,特异性引物H9-F和H9-R(20pmol/μL)及H6-F和H6-R(20pmol/μL)的加入量分别为0.7μL和1μL,用RNA-free水补足至终体积为25μL,退火温度53℃。该方法可在一个反应管内同时鉴别检测H9与H6亚型AIV,特异性强,敏感性高,可推广应用。 相似文献
9.
《江西农业学报》2022,(4)
根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×104拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。 相似文献
10.
根据GenBank中H9和H10亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因及所有亚型AIV M基因的保守序列,分别设计3对特异性引物,并优化退火温度和引物浓度及其配比等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H10亚型AIV的三重RT-PCR检测方法。特异性实验结果表明,该方法可以特异性地扩增出H9、H10亚型AIV及M基因对应大小的目的条带,而对其余亚型AIV仅M基因出现特异性条带,其它禽病病原体均未扩增出任何特异性条带。敏感性实验结果表明,该方法对H9、H10亚型HA基因及M基因质粒的扩增下限均为5×10~4拷贝/μL。此外,该方法对临床样品的检测结果与病毒分离及测序结果完全一致。 相似文献
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ZHANG Wen-hui GUO Hua WANG Wei-li LIU Ming QIAN Ai-dong .Jilin Agricultural University Changchun .Jilin Entry-Exit Inspection Quarantine Bureau of the People's Republic of China Changchun .National Key Laboratory of Veterinary Biotechnology Harbin Veterinary Research Institute of CAAS Harbin 《（《农业科学与技术》）编辑部》2008,(1)
[Objective] The research aimed to design primers that are suitable for detecting H5 and H7 subtypes of avian influenza virus(AIV);[Method] DNAStar was used to analyze the homology of the sequences of H5 and H7 subtypes of AIV accessed in GenBank,and design primers(by Primer Premier 5.0)on high homologous region of these sequences,and then amplified by RT-PCR.[Result] The multiplex RT-PCR amplification,agarose gel electrophoresis and sequencing results showed that the self-designed primers are successful for detecting AIV.[Conclusion] It is feasible to rapidly diagnose AIV through this method. 相似文献
12.
依据GenBank中亚洲流行株禽流感病毒(AIV)H5,H7,H9亚型血凝素基因及M基因序列保守区域设计特异性引物,利用多重反转录聚合酶链式反应技术建立了AIV及H5,H7,H9亚型的检测方法.该方法能一次性检测出AIV保守区域M基因的同时,直接区分H5,H7,H9亚型.对新城疲病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒等特异性检测均为阴性.样品经100倍稀释后仍能检出. 相似文献
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禽流感病毒4个亚型一步法多重RT-PCR检测方法研究 总被引：1，自引：0，他引：1
为了建立简便、快速的AIV检测方法,根据禽流感病毒H5、H7、H9亚型HA基因和N1亚型NA基因的保守序列,设计了4对RT-PCR引物,对H5、H7、H9、N1 4个亚型进行了多重RT-PCR扩增,通过多重RT-PCR敏感性和特异性试验,建立了多重RT-PCR检测方法;应用所建立的多重RT-PCR方法和病毒分离的经典方法对395份(4省20多个地区)口岸检样进行了平行检测,并对其检测结果进行了比较。结果表明,H5、H7、H9、N1 4个亚型的扩增产物大小分别为380,641,493和328 bp,对NDVI、BV、ARVI、BDV、MDV、FPV扩增均为阴性,平行检测结果完全吻合,说明所建立的多重RT-PCR检测方法具有较好的敏感性和特异性。 相似文献
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【目的】建立用于检测禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）且能同时区分H1和H3亚型AIV的方法,为有效防控禽流感（Avianinfluenza,AI）奠定基础。【方法】根据H1亚型、H3亚型AIV-HA基因和M基因的保守核苷酸序列,分别设计3对特异性引物,以含有H1亚型AIV和H3亚型AIV的cDNA为模板,对三重PCR扩增条件进行优化,验证其特异性和敏感性,并对临床样品进行AIV检测。【结果】H1和H3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带,其中302bp为H1亚型HA基因、453bp为M基因、626bp为H3亚型HA基因;含有H1或H3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带,大小分别为302和453bp、453和626bp;含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带（453bp）;而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的H1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亚型AIV;对100个临床样品进行AIV检测,AIV总阳性率为36%,其中H1亚型阳性率4%、H3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。【结论】禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等特点,适用于AIV的检测及H1和H3亚型AIV的分型检测。 相似文献
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禽流感病毒H5和H9亚型RT-PCR检测方法的建立 总被引：7，自引：2，他引：5
根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件,该方法敏感性可达10^-3,特异性好,与NFV、IBV与H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30％,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。 相似文献
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[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N-′（3-二甲氨基）丙基碳化二亚胺盐酸（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒（NDV）反应;检测灵敏度达到20~100EID50。[结论]该研究为深入研究检测禽流感病毒的免疫传感器奠定了基础,为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。 相似文献
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[目的]测定H9N2AIV4个毒株血凝素基因序列,并进行比较分析,从分子生物学角度了解各毒株间的差异和变异规律,进而了解该亚型禽流感的分布及流行规律：[方法]参照H9N2亚型禽流感HA基因序列设计1对引物,对禽流感A／Chicken／Hebei／WD／98（H9N2）、A／Chiken／Hebei／ZD／04（}19N2）、A／Chicken／Beijing／MY／06（H9N2）和A／Chicken／Beijing／PG／08（H9N2）4个毒株删基因进行扩增、克隆和测序,并将这4个毒株的HA基因序列分剐与GenBank登录的10个H9N2亚型禽流感毒株进行比较分析,[结果]获得了4个毒株圳基因（ORF）全长1683bp,编码561个氨基酸;4个毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为92．5％～95．6％和95．2％～96．8％;WD株、MY株、PG株和ZD株与其他10O个毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82．6％～95．1％、83．O％～99．0％、82．7％～95．5％、81．30％～95．7％、86．6％～96．3％、86．6％～97．9％、87．O％～97．1％、86．9％～97．3．[结论]HA基因在不同毒株间具有很高的同源性. 相似文献
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Lin SHI Xue-wu YU Wei YAO Ben-liang YU Li-kun HE Yuan GAO Yun-xian ZHANG Guo-bin TIAN Ji-hui PING Xiu-rong WANG 《农业科学学报》2019,18(7):1428-1435
In recent years, the avian influenza has brought not only serious economic loss to the poultry industry in China but also a serious threat to human health because of the avian influenza virus(AIV) gene recombination and reassortment. Until now, traditional RT-PCR, fluorescence RT-PCR and virus isolation identification have been developed and utilized to detect AIV, but these methods require high-level instruments and experimental conditions, not suitable for the rapid detection in field and farms. In order to develop a rapid, sensitive and practical method to detect and identify AIV subtypes, 4 specific primers to the conserved region of AIV M gene were designed and a loop-mediated isothermal amplification(RT-LAMP) method was established. Using this method, the M gene of H1–H16 subtypes of AIV were amplified in 30 min with a water bath and all 16 H subtypes of AIV were able to be visually identified in presence of fluorescein, without cross reaction with other susceptible avian viruses. In addition, the detection limit of the common H1, H5, H7, and H9 AIV subtypes with the RT-LAMP method was 0.1 PFU(plaque-forming unit), which was 10 times more sensitive than that using the routine RT-PCR. Further comparative tests found that the positivity rate of RT-LAMP on detecting clinical samples was 4.18%(14/335) comparing with 3.58%(12/335) from real-time RT-PCR. All these results suggested that the RT-LAMP method can specifically detect and identify AIV with high sensitivity and can be considered as a fast, convenient and practical method for the clinic test and epidemiological investigation of AIV. 相似文献
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[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险. 相似文献