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1.
利用双式荧光报告基因检测团头鲂β-actin启动子在家蚕BmN细胞和在家蚕体内的活性。通过脂质体介导法将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)混合均匀后转染BmN细胞,48h后,可以检测到同时发绿色荧光和红色荧光的家蚕细胞,表明来自团头鲂的β-actin启动子在家蚕BmN细胞具有活性,能驱动DsRed基因在家蚕BmN细胞中表达。以gfp、dsred的特异引物,可从pigA3GFPAβdsRed转化家蚕BmN细胞基因组内扩增出gfp、dsred相应大小的片段,提示外源基因已经插入到细胞基因组中。随着转化细胞的传代,绿色荧光稳定存在,而红色荧光会逐渐减弱直至检测不到,暗示β-actin启动子在家蚕细胞中容易受到家蚕BmN细胞因子的影响而活性减弱。将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)利用精子介导法导入家蚕受精卵,7天后,在部分受精卵中可观察到绿色荧光和红色荧光,进一步证明了β-actin启动子在家蚕体内具有活性。结果显示,含双式荧光报告基因的转基因载体为鉴定β-actin启动子等外源启动子在家蚕中的活性提供了快捷准确的鉴定方法。 相似文献
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piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探 总被引：5，自引：4，他引：1
为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。 相似文献
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采用基因打靶技术对家蚕丝素蛋白基因(fib)进行分子设计与遗传改造,探讨从基因水平改良蚕丝性能的可行性。以家蚕丝素轻链基因(fib-L)终止密码子TAA上游1.2 kb(fib-LL)和下游0.5 kb(fib-LR)片段作为基因打靶载体的左右同源臂,将绿色荧光蛋白基因(gfp)插入到两同源臂的中间,并使其与fib-L基因处于同一读码框,构建基因打靶载体pSK-FibL-L-GFP-FibL-R。将该载体质粒转染BmN细胞后,荧光显微镜下观察细胞呈现绿色荧光,表明载体构建成功。将该载体质粒通过精子介导法导入家蚕品种高白的卵,在G0代筛选出茧呈绿色荧光的家蚕,并通过PCR检测证实其为转基因家蚕;用GFP抗体对G3代转基因家蚕幼虫后部丝腺组织进行Western blotting检测,有分子质量为65 kD的Fib-L-GFP融合蛋白特异性条带呈现。转基因家蚕所产蚕丝在蓝光的激发下发出绿色荧光,表明通过基因打靶将gfp导入了家蚕丝素轻链基因中,并成功实现融合表达。 相似文献
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阳离子脂质体转染家蚕培养细胞的技术体系研究 总被引：1，自引：0，他引：1
阳离子脂质体转染家蚕培养细胞是家蚕基因功能研究的重要技术之一。利用阳离子脂质体Lipofectamine2000与pBac[A3Neo+A3EGFP]转基因表达载体,对家蚕卵巢细胞BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21进行了外源DNA质量、脂质体用量、转染细胞密度和转染孵育时间等4个转染条件的优化实验,筛选到了阳离子脂质体转染效率最高的细胞系BmN-SWU1。BmN-SWU1细胞的最佳转染条件为:外源DNA0.6μg,脂质体2.5μL,细胞密度1×105mL-1,无血清条件下孵育24 h。此条件下转染效率可达55.08%。用抗生素G418筛选转染后的BmN-SWU1细胞,建立了GFP转基因细胞系。 相似文献
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旋毛虫P53ES抗原基因的克隆及真核表达 总被引：2，自引：0，他引：2
应用RT-PCR方法扩增旋毛虫ES抗原P53基因,构建P53基因绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-P53,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7.于转染24 h后在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的转染细胞;同时通过westen blot分析证实了P53基因表达产物的抗原性.结果表明,P53基因在COS-7细胞中表达获得了表达,而且其融合蛋白具有免疫原性. 相似文献
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小鼠Dazl基因融合蛋白表达载体的构建及转染 总被引：1，自引：0，他引：1
根据NCBI数据库上公布的小鼠Dazl基因的mRNA序列设计引物,以小鼠睾丸组织RNA为模板,RT-PCR扩增小鼠Dazl基因编码区片段,并将其克隆到增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中,构建重组融合蛋白表达载体pEGFP C1-Dazl,单双酶切和测序验证正确.将pEGFP-Cl-Dazl质粒转染293和NIH 3T3细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞质表达;对照组转染pEGFP-C1,绿色荧光遍布整个细胞.Dazl蛋白的免疫荧光试验也证明重组载体转染后,Dazl基因和GFP共同定位于胞质部分.pEGFP C1-Dazl融合蛋白表达载体的成功构建为进一步研究生殖特异性基因Dazl在小鼠和大型动物的表达特性奠定了一定的基础. 相似文献
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将EGFPEO融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中,构建重组质粒pCI-EGFPE0.将重组质粒转染CHO(dhfr'),在荧光显微镜下观察到少数细胞呈现绿色荧光,表明转染成功.通过MTX加压筛选后,在荧光显微镜下观察到多数细胞呈现强绿色荧光,表明重组融合蛋白EGFPE0在CHO细胞中得到大量表达.高效表达重组融合蛋白细胞克隆的获得为进一步大量制备可溶性的猪瘟病毒E0糖蛋白、制备其单抗筛选抗原表位及研究E0蛋白的生物学功能奠定基础. 相似文献
9.
试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1：2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。 相似文献
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为了研究胰腺发育与缺陷的转基因特异性表达系统,探索胰腺特异性表达载体的构建并进行体外验证。以增强型绿色荧光蛋白(e GFP)为报告基因,小鼠PDX1启动子为特异性启动元件,构建胰腺特异性启动e GFP表达载体PDX1-e GFP,载体转染MIN-6胰岛β细胞和猪耳成纤维细胞,培养48 h后,进行荧光观察和RT-PCR、Western blot检测。结果显示,e GFP在MIN-6胰岛β细胞中的RNA水平和蛋白水平均表达,而在非胰腺细胞猪耳成纤维细胞中均不表达。本研究结果表明,成功获得胰岛特异性表达载体PDX1-e GFP,为构建相关基因在胰腺中特异性表达的载体提供依据,为制备胰腺缺陷动物奠定基础。 相似文献
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为了筛选肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株,研究利用人工合成的小鼠肌肉启动子SP,连接前期工作中获得带有GFP基因的小鼠MSTN基因RNA干涉载体pR-NAT-M1,构建真核表达载体pRNAT-SP-M1,将pRNAT-SP-M1线性化后转染小鼠成纤维细胞并通过300μg/mL G418筛选获得转基因阳性细胞。结果表明:获得的转基因阳性细胞呈现正常的小鼠成纤维细胞的梭形,且在荧光显微镜下呈现出表达绿色荧光蛋白的绿色;转基因阳性细胞的生长曲线呈"S"形;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍具有正常的细胞形态和增殖特性;PCR鉴定结果显示转基因阳性细胞基因组DNA中整合有pRNAT-SP-M1序列。说明成功获得了转肌细胞特异表达的MSTN基因RNA干涉序列小鼠成纤维细胞株。 相似文献
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为建立稳定表达乙型脑炎病毒(JEV) NS1蛋白的真核细胞系,本研究将编码JEV NS1蛋白的人工合成基因克隆到真核表达载体pCAGG-TK-neo中,构建了重组质粒pCAGG-opti-NS1.重组质粒经脂质体转染RK-13细胞,以含G418的选择性培养基选择培养,经细胞克隆纯化,以间接免疫荧光试验(IEA)筛选表达目的基因的细胞.结果表明,转染的RK-13细胞经G418加压及IFA筛选后,获得表达JEV NS1蛋白的阳性RK-13细胞系.经RT-PCR、western blot和IFA鉴定,该细胞系在传代至第15代后仍然可以稳定表达NS1蛋白.本实验获得了能够稳定表达JEV NS1蛋白的细胞系,为进一步开展JEV相关的研究奠定了基础. 相似文献
13.
旨在获得肌肉生长抑制素( Myostatin,MSTN)基因沉默的成纤维细胞系,为进一步探索Myostatin的调控机理,获得Myostatin的基因沉默的转基因羊奠定基础.针对小尾寒羊Myostatin的基因序列,设计4条siRNA干扰序列,构建pSilencer干扰载体,转染成纤维细胞,采用RT-PCR进行筛选;构建慢病毒干扰载体,包装病毒,感染成纤维细胞,采用流式细胞技术分选阳性细胞,阳性细胞予以测序鉴定并检测沉默效果.结果,获得Myostatin基因沉默效率约90％的RNA干扰片段PSL1,包装病毒获得滴度为1×108的病毒颗粒,流式细胞技术分选得到纯度达99％的Myostatin基因沉默成纤维细胞系.采用慢病毒感染接合流式细胞术分选,能较快获得无抗性标记的转基因阳性细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊及探索Myostatin的调控机理奠定基础. 相似文献
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为了探讨融合microRNA重组干扰载体构建的方法,为今后mi R-150对猪瘟病毒(CSFV)潜在的调控进行研究,利用生物信息学技术筛选出mi R-150,设计并合成了表达mi R-150的两条shRNA序列的DNA单链,将其退火后与干扰载体pGenesil-1连接,构建了含有mi R-150shRNA和绿色荧光蛋白基因的重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,提取并纯化质粒后,采用脂质体法将重组质粒转染PK-15细胞,用G418抗性筛选。经过酶切鉴定和测序鉴定,表明成功构建了重组干扰质粒pGene-mi R-150shRNA,并在转染24 h后即可检测到绿色荧光。本研究成功得到稳定表达mi R-150的细胞株,所建的方法可以应用于各种microRNA的构建。 相似文献
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试验旨在利用CRISPR-Cas9技术对蒙古牛胎儿成纤维细胞肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）基因进行编辑,构建无标记的MSTN基因敲除的蒙古牛细胞系,为培育肌肉发达的蒙古牛提供试验材料。通过组织块贴壁法对妊娠45 d的蒙古牛胎儿建立皮肤成纤维细胞系,同时在第2外显子区域选定1个gRNA靶位点,使用在线软件设计sgRNA序列,并选取评分较高的3个sgRNA,采用试剂盒法构建无标记的Cas9/gRNA载体,随后用T7E1酶酶切法对其进行活性验证,将有活性的载体用电转法转染蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过无限稀释法和口吸管法将转染后的单细胞接种于96孔板扩繁后提取DNA,对其进行PCR扩增及测序验证来获取阳性细胞。本试验构建了3个无标记的CRISPR-Cas9载体,经验证1个有活性,对电转染后的单细胞进行筛选共获得96个单细胞株,测序分析后有1个单细胞株发生单碱基突变,使得MSTN基因不能编码正常的蛋白。试验成功建立了1个MSTN基因失活的细胞株,可作为后续体细胞核移植的供体细胞,用于生产无标记的敲除MSTN基因的蒙古牛,对培养产肉率高并具有生物安全性的蒙古牛具有重要的意义。 相似文献
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试验旨在构建胆汁酸膜受体TGR5真核表达载体,转染293T细胞并在其中表达。用RT-PCR技术从胎盘组织中得到TGR5基因,克隆至真核表达载体pCMV-EGFP中。双酶切和测序鉴定正确后,将pCMV-EGFP-TGR5瞬时转染293T细胞,并采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测TGR5的表达。结果显示,本试验构建了TGR5真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5;转染293T细胞后,荧光显微镜观察到绿色荧光表达;实时荧光定量PCR检测TGR5表达量显著增加;Western blotting结果显示有目的蛋白表达。结果表明,真核表达载体pCMV-EGFP-TGR5构建成功,转染293T细胞后在基因、蛋白水平上均表达TGR5受体。 相似文献
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BmNPV多角体对稳定转化细胞表达荧光蛋白的包埋现象初探 总被引：1，自引：1，他引：0
为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体对外源蛋白的包埋特性,构建了含有绿色荧光蛋白基因(gfp)和红色荧光蛋白基因(DsRed)的表达载体pIZT-DsRed,用该载体转染家蚕卵巢细胞系(BmN),并以吉欧霉素(zeocin)筛选得到稳定表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的BmN细胞系。进一步以野生型BmNPV感染pIZT-DsRed转化BmN细胞,发现部分多角体可以发出绿色荧光和红色荧光,Western blot检测证明多角体中含有GFP蛋白,显示BmNPV多角体可以包埋进病毒粒子以外的其他蛋白成分,表明BmNPV多角体蛋白的包埋机制中存在非特异性识别包埋的现象。 相似文献
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对肾型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ck/Jiangsu/DS10/2008株(DS10株)S基因进行扩增、克隆和序列测定,并与GenBank中的其他25株参考株构建进化树进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9昆虫细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。S基因序列分析表明,S基因高变区域主要集中在157～230位、349～433位、787～886位之间,裂解位点序列为SHRRRRμSI。遗传进化分析表明,DS10与Vic株处于同一分支,而与H120等常用疫苗株相距较远。经间接免疫荧光检测表明,S蛋白在Sf9细胞中得到表达,琼扩试验验证表达产物具有良好的反应性,表明所表达的S蛋白具有良好的生物学活性。本研究表达的S蛋白可为传染性支气管炎诊断抗原的研制、新型疫苗的开发等提供基础材料。 相似文献